Metode til direkte Segmentoplysninger Intra-hepatisk Levering Ved hjælp af en rotte Lever hilar Clamp Model

Medicine
 

Summary

En unik rottelever hilar clamp model blev udviklet til at studere virkningen af ​​farmakologiske molekyler til bedring iskæmireperfusionsbeskadigelse. Denne model omfatter direkte kanylering af portalen levering til den iskæmiske leveren segment via en gren af ​​portåren, hvilket muliggør direkte hepatisk levering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Mumtaz, K., Hayes Jr., D., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model. J. Vis. Exp. (122), e54729, doi:10.3791/54729 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Større hepatisk kirurgi med indstrømning okklusion, og levertransplantation, nødvendiggøre en periode med varm iskæmi, og en periode med reperfusion fører til iskæmi / reperfusion (/ R) skade med utallige negative konsekvenser. Potentiel I / R skade i marginale organer bestemt til levertransplantation bidrager til den aktuelle donor mangel sekundært til en nedsat organ udnyttelsesgrad. En betydelig behov for at udforske hepatisk I / R skade for at mediere dens indvirkning på transplantatfunktion i transplantation. Rotte lever hilar clamp modeller bruges til at undersøge virkningen af ​​forskellige molekyler på hepatisk I / R skade. Afhængig af modellen, er disse molekyler blevet leveret ved hjælp af inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injektion, intravenøs indgivelse eller injektion i det perifere øvre mesenteriske vene. En rottelever hilar clamp model er blevet udviklet til anvendelse i at studere virkningen af ​​farmakologiske molekyler i mildning I / R skade. den described model for rottelever hilar klemme omfatter direkte kanylering af portalen levering til den iskæmiske hepatisk segment via en sidegren af ​​portåren, hvilket muliggør direkte segmental hepatisk levering. Vores tilgang er at inducere iskæmi i venstre laterale og medianværdier lapper i 60 minutter, i hvilket tidsrum undersøgte stof infunderes. I dette tilfælde pegyleret-superoxiddismutase (PEG-SOD), en fri radikal-scavenger, infunderes direkte i iskæmiske segment. Denne serie af eksperimenter viser, at infusion af PEG-SOD er ​​beskyttende mod hepatisk I / R skade. Fordelene ved denne fremgangsmåde indbefatter direkte injektion af molekylet i den iskæmiske segment med deraf følgende fald i fordelingsvolumen og reduktion af systemiske bivirkninger.

Introduction

Større hepatisk kirurgi med indstrømning okklusion, og levertransplantation, nødvendiggøre en periode med varm iskæmi, og en periode med reperfusion fører til iskæmi / reperfusion (/ R) skade 1. Konsekvenserne af I / R skade i leveren er blevet beskrevet udførligt 1, 2, 3. Konsekvenser af I / R skade beskrevet i litteraturen: generering af reaktive oxygenarter, initiering af den inflammatoriske kaskade, inklusiv aktivering af neutrofiler, Kupffer-celler, og endotelceller, aktivering af hæmoxygenase systemet og aktivering af toll-lignende receptorer, en ubalance mellem endotelin og nitrogenoxid, aktivering af nukleær faktor-KB, og fremme af proinflammatorisk cytokin og adhæsionsmolekyle syntese 1, 2, 3. Disse proinflammatoriske hændelser kan lead til apoptose, nekrose, organdysfunktion og eventuel organsvigt 3.

I / R skade i organer bestemt til levertransplantation kan føre til tidlig grafttab og bidrager til den aktuelle donor mangel som marginale organer er mere modtagelige for skade 3. Der er i øjeblikket 15.226 potentielle modtagere på venteliste til levertransplantation i USA 4 og kun 5950 levertransplantationer blev udført i 2015 5. På grund af denne ekstreme begrænsning ved organ- tilgængelighed, forskning udforske er behov hepatisk I / R skade for at optimere transplantatfunktion og orgel udnyttelse.

Dyremodeller anvendt til at undersøge hepatisk I / R skade indbefatter rotte hilar clamp modeller og rottelever transplantationsmodeller. Der er en række af rotte hilar clamp modeller for nærværende er i brug. Den mest almindelige er en, hvor portalen vene, hepatisk arterie og galde duct forsyning af de venstre laterale og median lapper spændes ved at anvende mikrokirurgiske klemmer 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 30 til 60 min 6, 7, 10, 13, 14, og derefter en periode med reperfusion fra 60 min til 24 timer 7, 9, 10, 13 er 14 tilladt. De venstre laterale og median kamre af rottelever omfatter ca. 70% af den hepatiske parenchym 9. Nogle protokoller til formål at studere iskæmisk prækonditionering indbefatter intermitterende fastspænding af hilar fartøjereller bagbenet forud for en længere periode med iskæmi induceret ved fastspænding af hilar fartøjer 9, 13. Der er også beskrevet i litteraturen adskillige modifikationer. Den første er at klemme portåren og hepatiske arterie forsyne de venstre laterale og median lapper, men udelukke galdegangen 15. En anden modifikation er at inducere samlede hepatisk iskæmi ved at klemme portåren, hepatiske arterie og galdegang forud for deres division 16, 17, 18, 19, 20. En tredje modifikation indbefatter fastspænding af hilar fartøjer til højre lap i 30 til 60 min 8. En yderligere modifikation indebærer fastspænding af vaskulære bundt i et bagben for at inducere skade i leveren 13, 21 figur 1A-D.

Rotte lever hilar clamp modeller er blevet anvendt til at undersøge virkningen af ​​forskellige molekyler og forbindelser på hepatisk I / R. Afhængig af modellen anvendte disse molekyler er blevet leveret ved hjælp af inhalering 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenøs administration 10, 14, 15, 19, 23, 24 eller injektion i det perifere øvre mesenteriske vene 8 .

Modellen for rottelever hilar clamp beskrevet i denne rapport includes direkte kanylering af portalen levering til den iskæmiske segment via en sidegren af portåren (figur 2), som giver mulighed for direkte segmental hepatisk levering af farmakologiske undersøgte stof. Vores tilgang er at inducere iskæmi i venstre laterale og medianværdier lapper i 60 minutter, i hvilket tidsrum en infusion af stoffet under undersøgelse, i dette tilfælde, pegyleret-superoxiddismutase, en fri radikal-scavenger 25, infunderes direkte i iskæmiske segment . Blodprøver taget før induktion af iskæmi og ved 120 minutter efter reperfusion. På dette tidspunkt er rotten aflivet, og der udtages prøver fra de venstre og median lapper. Derudover tages der prøver fra højre lap til at tjene som en intern kontrol.

Der er mange fordele ved denne fremgangsmåde. Først og fremmest, når den farmakologiske undersøgte stof kan injiceres direkte i den iskæmiske segment volumen of fordeling er ganske lav i sammenligning med volumenet af fordeling af injektion i det systemiske kredsløb eller bughulen. Desuden er denne fremgangsmåde mindsker, skønt ikke eliminerer muligheden for systemiske bivirkninger.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og National Research Council Guide til Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (IACUC) og har gennemgået godkendelse fra Ohio State University IACUC udvalg.

1. Indledende opsætning

  1. Set-up det kirurgiske mikroskop og operationsstuen (figur 3, figur 4). Tænd alt udstyr, herunder, at for at opretholde anæstesi og overvågning af vitale tegn. Tænd den elektrokirurgiske enhed og opvarmning pad. Placer infusionspumpe nær operationsbordet.
    1. Udarbejde 10 ml væske isofluran til inhalation (molvægt 184,5) i anæstesi sprøjten og placer den i anæstesi enhed.
    2. Etablere et 200 ml beholder med flydende nitrogen nær operationsbordet og en anden nær centrifugen hvor blodprøver skal forarbejdes.
    3. Position de kirurgiske instrumenter, 4-0 og 7-0 flettet silke sutur, sterile vatpinde, 4x4 ikke-vævede svampe, 5 ml sprøjter og 27 gauge insulin sprøjter nær operationsbordet.
  2. Forbered isofluran kammer og sikre, at tilstrækkelig isofluran inddryppes i anæstesi induktion leveringssystem.

2. Induktion af anæstesi

  1. Før du håndterer rotten sat på følgende personlige værnemidler (PV): kirurgisk maske, kirurgiske handsker, og disponibel kjole.
  2. Vejes rotten og massen noteres.
    BEMÆRK: bør anvendes Sprague Dawley rotter.
  3. Placer rotte i anæstesi kammeret og tænd for isofluran og oxygen. Narkosen hjælp af isofluran kammer.
  4. Clip dyrets abdominale hår ved hjælp af en elektrisk hårklipper at muliggøre renere eksponering (figur 5).
  5. Sende dyret tilbage i isofluran kammer til en Additional et minut. Udfør en tå knivspids at kontrollere dybden af ​​anæstesi.

3. Procedure

  1. Placer rotte med dyrets næse i næsekeglen og fire ekstremiteter immobiliseret med begrænsninger eller tape på varmepude.
  2. Fortsætte anæstesi under anvendelse af anæstesi leveringssystem, næsekeglen og isofluran ved bedøvelse på 3,6% for dyr, der vejer mellem 200 og 250 g og 4% for dyr, der vejer mere end 250 g. Bekræft anæstesidybden ved at udføre en tå knivspids og en hud knivspids.
  3. Foretag en midtlinje abdominal incision fra pubis til xiphoid gennem huden ved hjælp af en skarp saks (figur 6).
  4. Lav et snit i bughinden langs linea alba fra pubis til formet som et sværd og indtaste maven pas på ikke at beskadige blæren eller tarmen. Som leveren også klæber til bughinden anteriort nær formet som et sværd proces, sikre, at den frigiver før indsnit i bugvæggen i denne area.
  5. Lav en tværgående snit gennem huden og bughinden på niveau med den nedre grænse af højre lap af leveren.
  6. Drej anæstesi ned til 1,6% for dyr, der vejer mellem 200 og 250 g og 2% for dyr, der vejer mere end 250 g.
  7. Trække xiphoid proces under anvendelse af en buet myg klemme.
  8. Sted rib retraktorer trækker ribberne så langt fra hinanden som muligt fra midterlinjen (figur 7). Skær falciforme, phrenic og gastrisk ledbånd. Flip leveren op ved hjælp fugtige sterile vatpinde.
  9. Skær yderligere ledbånd som nødvendigt for at få adgang til Porta. Udføre visceral rotation med saltvand fugtet gaze (figur 7).
  10. Fjern løst bindevæv overliggende portalen hilum hjælp skarp eller stump dissektion. Fjern løst bindevæv overliggende længden af ​​portalen vene.
  11. Brug pincet til at skubbe igennem den løse bindevæv tproblem posteriort til venstre portal vene, arterie og galdegang gør et vindue og placere 4-0 Potts sutur men ikke phono ned (figur 8).
  12. Ryd ud i løst bindevæv overliggende den bageste gren til portalen vene, der kommer ind på omtrent niveauet for den højre nyre. Denne vene vil blive anvendt til kanyle.
  13. Trække 0,5 ml blod ud af den nedre vena cava (IVC) med en insulinsprøjte (figur 9). Placer 0,5 ml blod i et lille hætteglas, centrifugeres ved 135 xg i 12 minutter. Forsøg på at trække off serum.
    1. Hvis en distinkt linie ikke kan blive værdsat mellem røde blodlegemer og serum, forsøge at centrifugere i yderligere 2 - 3 i minutter ved 135 x g. Aftrække serum og sted i et hætteglas for alanin-aminotransferase (ALT). Snap fryse denne prøve ved at placere det direkte i flydende nitrogen.
  14. Skær to stykker af 7-0 sutur og sted nær den vene, der vil blive anvendt til kanyletion. Placer den første 7-0 løkken omkring denne vene så langt mediale som muligt. Bind denne sløjfe og bruge den til at trække ved hjælp af en buet myg klemme (figur 10). Placer en anden 7-0 loop på vene, der vil blive anvendt til kanylering nær skæringspunktet med portalen vene og placere et slips, men ikke phono ned.
  15. Forberede infusionspumpen med en 5 ml sprøjte med 3 ml af reagens. Prime slangen.
  16. Klemme distal portåren under anvendelse af en mikrokirurgisk klemme.
    BEMÆRK: Dette vil reducere blødninger, mens venen er indskåret til kanylering.
  17. Skær et 0,5 mm hul i venen i mellem 7-0 ophold sutur og skæringspunktet med portalen vene ved hjælp af små mikrokirurgiske saks. Brug 27-0 kateteret til kanylere venstre portvenesystemet (figur 11, figur 12). Sæt kateteret forbi tvedeling af venstre og højre portal vener.
  18. Kontroller placeringen af ​​kanylen ved infusing 1 ml normalt saltvand og se for de venstre laterale og median leverlapper til blanchere. Manuelt bekræfte, at kateteret er forbi take-off af den højre portalen vene, men ikke ud over den start af portalen vene fodring medianen lap.
  19. Cinch ned Potts sutur og begynde iskæmi tid. Spænd 7-0 sutur omkring venen og 27-0 kateteret for at holde det på plads og fjerne klemmen fra den distale portal vene.
  20. Start infusionen af ​​polyethylenglycol-superoxiddismutase (PEG-SOD, 0,00067 g / ml) under anvendelse af infusionspumpen. Start infusionen så tæt som muligt på starten af ​​den iskæmiske tid.

4. Overvågning

  1. Fortsæt med at overvåge dyrets vitale tegn i hele infusionen. Levere 2 ml 0,9% normalt saltvand eller 2 ml af PEG-SOD (0,00067 g / ml) opløst i 0,9% normal saltopløsning over en periode på 15 min.

5. Reperfusion

  1. Tillad en time til at passere fra begyndelsen af ​​ischemic tid. Dette er 1-h af varm iskæmi tid.
  2. Fjern Potts sutur. Fjern 27-0 kateter. Cinch ned 7-0 sutur rundt venen. Bemærk tiden. Dette markerer tidspunktet for reperfusion.

6. Fortsat Prøveudtagning

  1. Trække 0,5 ml blod ud af IVC ved 120 minutter efter reperfusion. Tegn blodet langsomt for at undgå lysere røde blodlegemer. Langsomt drypper blodet i et hætteglas. Sikre, at blødning fra IVC styres efter hver blodudtagning.
    1. Hvis der fortsættes blødning tryk forsigtigt med en steril vatpind eller en lille 1 cm x 1 cm snit skåret fra gaze.
  2. Centrifugere ved 135 xg i 12 min. Hvis der er tilstrækkelig adskillelse ikke opnås, prøve en yderligere 2 - 3 i minutter ved 135 x g.
  3. Placer halvdelen af ​​serum i et hætteglas til senere behandling for ALT. Snap fryse disse prøver.

7. Eutanasi

  1. Mens rotten er stadig under anæstesi sender en IVC og superior vena cava (SVC) og overvåge indtil blodgennemstrømning, åndedræt og hjerteslag ophører.
  2. Incise membranen og udføre en kort hepatektomi ved indskæring membranen i en cirkel og incising yderligere bindevæv, der forbliver forbinder leveren til bughulen. Fjern leveren fra det peritoneale hulrum.
  3. Tag fire prøver fra venstre og medianværdier leverlapper og fire prøver fra højre lap af leveren. Prøverne skal være så stor som muligt, og deres størrelse vil være begrænset af mængden af ​​tilgængelig levervæv. Anbring disse i små, mærkede hætteglas, og snap fryse i flydende nitrogen. Bruge disse til senere bearbejdning for vævs adenosintriphosphat (ADP), malondialdehyd (MDA) og glutathion (GSH).

8. Post-eksperiment Analyse

  1. Bestemme glutathion (GSH), malondialdehyd (MDA) og alaninaminotransferase (ALT) aktiviteter i levervæv og serumprøver under anvendelse af diagnostiske kitsi henhold til producentens anvisninger.
  2. Homogenisere levervævet med lysepuffer og kvantificere anvendelse af et Bradford-assay. Analyser væv lysat ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og immunoblot ved anvendelse af antistoffer mod spaltet Capase-3 og actin. Kvantificere Western blots udført med offentligt tilgængelige software.

Representative Results

Dette eksperiment blev udført med 2 grupper af n = 3 rotter hver. Tre rottelevere blev injiceret med 2 ml normalt saltvand (NS) med infusionspumpen over en periode på 15 min. Tre rottelevere blev injiceret med 2 ml normalt saltvand (NS) blandet med pegyleret-superoxiddismutase (PEG-SOD, 0,00067 g / ml) med infusionspumpen over en periode på 15 min. Som beskrevet i den ovennævnte protokol, blev der taget blodprøver før hilar klemme og ved 120-min post-reperfusion. Derudover efter afslutningen af ​​120-minutters reperfusion fire levervævsprøver blev taget på venstre median lapper og fire leverprøver blev taget fra højre lap af rottelever.

Serumalaninaminotransferase (ALT) blev målt før hilar klemme og ved 120-min post-reperfusion i kontrol (NS) og eksperimentel (PEG-SOD) dyr. Der var en signifikant forskel mellem ALT kontrolniveau (NS)dyr præ-hilar clamp og ved 120-min post-reperfusion. Der var en signifikant forskel mellem ALT kontrolniveau (NS) og forsøgsdyr (PEG-SOD) ved 120-min (figur 13A). Tissue malonaldehyd (MDA) blev målt for kontrol (NS) og eksperimentel (PEG-SOD) dyr i både højre og venstre leverlapper. Væv MDA i højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) og eksperimentel injektion (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskel. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) væv MDA med kontrol injektion (NS) er væsentlig anderledes end højre lap (ikke-hilar klemme) p <0,001. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) har markant forskellige niveauer af væv MDA med kontrol injektion (NS) versus eksperimentel injektion (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13B). Vævsglutathion (GSH) blev målt og vævsglutathion i højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) ennd eksperimentel injektion (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskel. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) væv GSH med kontrol injektion (NS) er væsentlig anderledes end højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) p <0,05. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) har markant forskellige niveauer af vævsglutathion med kontrol injektion (NS) versus eksperimentel injektion (PEG-SOD) p <0,005 (figur 13C). Western blot udførtes sammenligning højre og venstre lap af kontroldyr og demonstrerer øget spaltet caspase-3 i den venstre lap efter hilar klemme og reperfusion (figur 13D). En anden western blot blev udført sammenligne de venstre lapper af dyr behandlet med kontrol og med PEG-SOD (figur 13E). Dette viser formindsket spaltet caspase-3 i levervæv fra dyr behandlet med PEG-SOD. Densitometri blev også udført demonstrationrancer, at niveauet af spaltet caspase-3 i levervæv øges signifikant i venstre versus højre lap af kontroldyr (Fig 13F). Ved sammenligningen venstre lap levervæv fra forsøgsdyr, infunderes med PEG-SOD, og ​​venstre lap levervæv fra kontroldyr, infunderes med normalt saltvand, demonstrerer densitometri signifikant nedsat spaltet caspase-3 i dyr behandlet med PEG-SOD i sammenligning med dyr behandlet med kontrol (figur 13G).

figur 1
Figur 1: Anatomical Illustrationer. A. Anatomisk illustration af rottelever. B. Anatomisk illustration af rottelever. Portalen stilken til venstre og median leverlapper er fastklemt. Den venstre og median lapper er iskæmisk. C. Anatomiskillustration af rottelever. Portalen stilken til venstre lap er fastklemt. Venstre lap er iskæmisk. D. Anatomisk illustration af rottelever. Portalen stilken til højre lap er fastspændt og højre lap er iskæmisk.

figur 2
Figur 2: Anatomical Illustrationer. Anatomisk illustration af rottelever med portåren kanyle via en sidegren. Portalen stilken til venstre og medianværdier leverlapper er omgivet af en sutur og en mikrokar klemme er blevet brugt til at stramme omkring det vaskulære bundt. Den venstre og median lapper er iskæmisk.

figur 3
Figur 3: Instrument Set-up. Dette tal viser th e instrument set-up.

figur 4
Figur 4: operationsstuen Set-up. Dette tal viser operationsstuen set-up. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5: Trimning af Abdominal Hair. Dette tal viser trimning af abdominale hår. Klik her for at se en større version af dette tal.

belastning / 54729 / 54729fig6.jpg"/>
Figur 6: Immobilisering og Hud Incision. Denne figur viser immobilisering af rotter og huden indsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 7
Figur 7: Rib Retractor Placement og Organerne. Denne figur viser ribben retraktoren placering og udtagning af indvolde. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 8
Figur 8: Place ling af sutur. Dette tal viser placeringen af ​​sutur. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 9
Figur 9: Blood Draw fra vena cava inferior. Dette tal viser blodprøve fra vena cava inferior. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 10
Figur 10: Vein Branch hæftes og Retracted. Dette tal viser vene gren hæftes og tilbagetrukket. ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11
Figur 11: Processen med Kanylering. Denne figur viser processen med kanyle. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 12
Figur 12: Kanylering. Dette tal viser kanyle. Klik her for at se en større version af dette tal.

indhold" fo: keep-together.within-side = "1"> figur 13
Figur 13: Repræsentative resultater: Direkte Segmental Intrahepatisk Levering af pegyleret-superoxiddismutase anvendelse af en rotte hilar Clamp Model. NS = normal saltopløsning. PEG-SOD = pegyleret-superoxiddismutase, ALT = alaninaminotransferase, MDA = malondialdehyd. A. serumalaninaminotransferase (ALT, mU / ml) sammenlignet mellem præ-hilar klemme og 120-min post-reperfusion. Der er en signifikant forskel mellem kontrol (NS) præ-hilar klemme og kontrol (NS) ved 120-min post-reperfusion (p <0,001). Der er også en signifikant forskel mellem kontrol (NS) og forsøgsgrupper (PEG-SOD) ved 120-min post-reperfusion (p <0,05). En t-test blev anvendt. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. B. Tissue malondialdehyd i højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) end eksperimentel injektion (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskel. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) væv malondialdehyd med kontrol injektion (NS) er væsentlig anderledes end højre lap (ikke-hilar klemme) p <0,001. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) har signifikant forskellige væv malonaldehyd med kontrol injektion (NS) versus eksperimentel injektion (PEG-SOD) p <0,005. En t-test blev anvendt. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. C. Tissue glutathion i højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) og eksperimentel injektion (PEG-SOD) viser ingen signifikant forskel. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) vævsglutathion med kontrol injektion (NS) er væsentlig anderledes end højre lap (ikke-hilar klemme) med kontrol injektion (NS) p <0,05. Venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) har markant forskellige niveauer af vævsglutathion med kontrol injektionsvæsken (NS) versus eksperimentel injektion (PEG-SOD) p <0,005. En t-test blev anvendt. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. D. Western-blot der viser forøget spaltet caspase-3 i levervæv fra venstre lap (post-hilar klemme og reperfusion) versus den højre lap (ikke-hilar klemme) af kontroldyr (normalt saltvand). E. Western blot demonstrerer reduceret spaltet caspase-3 i levervæv fra dyr behandlet med PEG-SOD i sammenligning med dyr behandlet med kontrol (normalt saltvand). F. Niveau af spaltet caspase-3 i levervæv er signifikant forøget i post-hilar clamp og reperfusion dyr (p <0,05). En t-test blev anvendt. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. G. Ved sammenligning venstre lap levervæv af forsøgsdyr (infunderes med PEG-SOD) og venstre lap levervæv fra kontroldyr (infunderes med normalt saltvand), der er betydeligt formindsket spaltet caspase-3 i enimals behandlet med PEG-SOD i sammenligning med dyr behandlet med kontrol (normalt saltvand). En t-test blev anvendt. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen.

Discussion

Denne serie af forsøg viste, at injektion af PEG-SOD ind i venstre og median lapper førte til signifikante fald i frigivelsen af ​​ALT, lipidperoxidation af cellemembraner (MDA), og vedligeholdelse af glutathion (GSH) i sammenligning med kontroller (Normalt saltvand ). Levervæv transaminaser herunder Alaninaminotransferase (ALT) er etableret markører af hepatocellulær beskadigelse. Faldet i ALT når venstre lap injiceres med PEG-SOD antyder en beskyttende virkning af PEG-SOD. Øget væv MDA indikerer øget lipidperoxidation og betragtes som en markør for oxidativt stress og vævsbeskadigelse. Overproduktion af reaktive oxygenformer forårsager en stigning i produktionen af MDA 26. Den betydelige reduktion i væv MDA i dyrets venstre og median lapper når injiceres med PEG-SOD demonstrerer en beskyttende effekt af PEG-SOD. Dette er i overensstemmelse med den nuværende forståelse, at PEG-SOD beskytter celler mod skaderforårsaget af delvist reduceret reaktive oxygenarter 27. Derudover er der i nærværelse af reaktive oxygenarter, er glutathiondisulfid reduceret til glutathion (GSH) 28. Opretholdelsen i GSH i venstre og median leverlapper injiceret med PEG-SOD yderligere styrker den beskyttende virkning af PEG-SOD. Desuden det påvises, at der er forøget spaltet caspase-3, et produkt fra apoptose i væv udsat for iskæmi-reperfusionsskade. Faldet i spaltede caspase-3 i den venstre lap, når de behandles med PEG-SOD tyder på, at PEG-SOD fører til et fald i apoptose.

Superoxiddismutase (SOD) er et kritisk enzym i detoksifikationsproceduren af ​​reaktive oxygenarter. Enzymet katalyserer omdannelsen af ​​to superoxidanioner i hydrogenperoxid og vand. Enzymet katalase omdanner derefter hydrogenperoxid til vand og oxygen, og processen afsluttes 25. Halveringstiden afnativ SOD begrænset dens anvendelse i forsøgsmodeller, indtil udviklingen af ​​konjugerede polyethylenglycol-superoxiddismutase (PEG-SOD). Konjugering af SOD til polyethylenglycol forøger dets halveringstid fra 6 min til 14 timer. Nguyen et al. vist sin evne til at mindske lipidperoxidation i hepatisk iskæmi i en rottemodel ved anvendelse systemisk levering 29.

Der er en række potentielle modifikationer af teknikken beskrevet her, og nogle er tidligere blevet beskrevet i litteraturen. Afhængig af den anvendte model molekyler er blevet leveret ved hjælp af inhalation 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenøs administration 10, 14, 15 19, 23, 24 eller injektion i det perifere øvre mesenteriske vene 8.

Der er flere kritiske trin i denne protokol. Det vigtigste er kanylering af portalen vene. Der skal udvises forsigtighed, at hullet skæres i venen ikke er for stor. Vævet er meget elastisk og hullet vil udvide på egen hånd. Vi anbefaler at starte ved at skære et hul, der er 0,5 mm med de mikrokirurgiske saks. Kanylen kan føres gennem hullet ved anvendelse af et instrument, som giver mulighed for større fleksibilitet, end hvis forsøger at udføre denne del af proceduren med hånden. Og mens oprindeligt fodring kanylen, det bør være rettet direkte mod forgreningen af ​​venstre og højre portal vener for at undgå stikke et hul gennem bagvæggen af ​​venen. Når kanylen spids når forgreningen, kan det derefter føres ind i venstre vene specifikkeallieret. Når kanylen føres ind i venstre portalen vene, som leverer både venstre og median lapper, kan dets position bekræftes manuelt ved at føle det inde i venen. Dens position kan også bekræftes ved at injicere en lille mængde koldt saltvand og se blancheringen virkning på de medfølgende segmenter af leveren.

Leveren hilar clamp model i rotten giver en reproducerbar og stabil platform for at demonstrere hepatisk iskæmisk-reperfusionsbeskadigelse. Variable hilar clamp modeller er blevet anvendt af forskere til at undersøge de beskyttende virkninger af anti-oxidanter og andre små molekyler 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Af forskellene omfatte, hvilke skibe er clamp ed, hvilket segment er gjort iskæmisk, hvorvidt galdegangen er inkluderet, og længden af perioden for reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Derudover, når denne model anvendes til at undersøge virkningen af administration af et molekyle indgivelsesvejen er også heterogen 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Der er flere fordele af den beskrevne fremgangsmåde. Først direkte kanylering af portalen levering til den iskæmiske segment giver mulighed for direkte segmental hepatisk levering af den farmakologiske undersøgte stof. Dette muliggør udnyttelse af de andre lapper af leverne som en intern kontrol. for det andet, segmental hepatisk kanylering tillader en reduceret fordelingsvolumen for molekylet, der undersøges. Denne fremgangsmåde reducerer derved risikoen for systemiske bivirkninger som stoffet injiceres direkte ind i leveren segment af interesse. direkte kanylering af den hepatiske segment tillader stoffet, der skal leveres præ-iskæmi, Intra-iskæmi eller post-iskæmi. Dette giver mulighed for undersøgelse af molekylets effekt på ethvert punkt i iskæmi-reperfusionsskade cyklus. Med øget længde af iskæmisk tid og øget niveau af skade yderligere mulighed for at studere leverregenerering ville være tilgængelige.

Der er også nogle begrænsninger i denne fremgangsmåde. Den første er opstart omkostninger. Køb af en kirurgisk mikroskop kunne være en betydelig opstart omkostninger for en lab, der ikke allerede har en. Denne teknik kan være vanskeligt eller umuligt uden et mikroskop. Den anden er at lære kurve tid. Selv om denne fremgangsmåde er relativt simpel det kræver lidt øvelse, og det er sandsynligt, at en nybegynder vil kræve et betydeligt antal procedurer for at blive en ekspert.

Sammenfattende denne model giver mulighed for en reproducerbar, enkel og omkostningseffektiv platform til at studere hepatisk iskæmi-reperfusion skade. Selv i protokollen beskrevet her polyethylen glycol-superoxiddismutase, en fri radikal-scavenger 25, blev infunderet, kan denne model anvendes til infusion af en række forskellige farmakologiske stoffer for at evaluere deres virkning på I / R skade i leveren.

Disclosures

Alle forfattere rapporterer de ikke har nogen oplysninger.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Dennis Mathias for hans illustrative arbejde. Dette arbejde blev støttet af NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch fond for organtransplantation, Perfusion, Engineering og Regeneration på The Ohio State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley Rat  Harlan Sprague Dawley Inc.  200- 250 grams 
Surgical Microscope  Leica  M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Molecular Weight 184.5  Piramal Healthcare
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe   Valco Instruments Co, Inc.  SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan  MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific  HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific  SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific  PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber  Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen  Praxair 98015
27-0 Micro-Cannula Braintree Scientific  MC-28
Rib retractors  Kent Scientific  INS600240
Polyethylene Glycol - Superoxide Dismutase (PEG-SOD) Sigma Aldrich  S9549 SIGMA
GenieTouch Kent Scientific
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4 x 4 Non-Woven Sponges  Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5 mL Syringe BD  REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical  REF 103-S
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific  1418-7410
Microsurgical Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Scissors  Roboz  RS-5610
Large Scissors S&T  SAA-15
Forceps - Large Angled S&T  JFCL-7
Forceps - Small Angled  S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip  S&T  FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Other Instruments
Name Company  Catalog Number Comments
Small Mosquito Clamps Generic 
Analysis 
Name Company  Catalog Number Comments
Alannine aminotransferase (ALT) assay  Biovision K752-100
Malondialdehye (MDA) assay  Abcam  ab118970
Glutathione (GSH) assay Cayman Chemical 7030002
Antibodies - Cleaved Caspase-3 and Actin  Cell Signaling Tecnology Antibody 9661
ImageJ Software  National Institutes of Health 
RIPA Lysis and Extraction Buffer  Millipore 10-188

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serracino-Inglott, F., Habib, N. A., Mathie, R. T. Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg. 181, 160-166 (2001).
  2. Fondevila, C., Busuttil, R. W., Kupiec-Weglinski, J. W. Hepatic ischemia/reperfusion injury--a fresh look. Exp Mol Pathol. 74, 86-93 (2003).
  3. Kupiec-Weglinski, J. W., Busuttil, R. W. Ischemia and reperfusion injury in liver transplantation. Transplant Proc. 37, 1653-1656 (2005).
  4. OPTN. Overall by Organ. Current US Waiting List. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  5. OPTN. Transplants in the US by Recipient ABO. https://optn.transplant.hrsa.gov/converge/latestData/rptData.asp (2016).
  6. Tacchini, L., Radice, L., Pogliaghi, G., Bernelli-Zazzera, A. Differential activation of heat shock and nuclear factor kappaB transcription factors in postischemic reperfused rat liver. Hepatology. 26, 186-191 (1997).
  7. Palladini, G., et al. Lobe-specific heterogeneity and matrix metalloproteinase activation after ischemia/reperfusion injury in rat livers. Toxicol Pathol. 40, 722-730 (2012).
  8. Nakano, H., Kuzume, M., Namatame, K., Yamaguchi, M., Kumada, K. Efficacy of intraportal injection of anti-ICAM-1 monoclonal antibody against liver cell injury following warm ischemia in the rat. Am J Surg. 170, 64-66 (1995).
  9. Centurion, S. A., et al. Effects of ischemic liver preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. Transplant Proc. 39, 361-364 (2007).
  10. Kobayashi, H., et al. Role of endogenous nitric oxide in ischemia-reperfusion injury in rat liver. J Surg Res. 59, 772-779 (1995).
  11. Strifler, G., et al. Inhaled Methane Limits the Mitochondrial Electron Transport Chain Dysfunction during Experimental Liver Ischemia-Reperfusion Injury. PLoS One. 11, e0146363 (2016).
  12. Sarikus, Z., Bedirli, N., Yilmaz, G., Bagriacik, U., Bozkirli, F. The effects of epidural bupivacaine on ischemia/reperfusion-induced liver injury. Bratisl Lek Listy. 117, 41-46 (2016).
  13. Guimarães Filho, A. M., et al. Effect of remote ischemic preconditioning in the expression of IL-6 and IL-10 in a rat model of liver ischemia-reperfusion injury. Acta Cir Bras. 30, 452-460 (2015).
  14. Liu, Q. S., et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway. Transplant Proc. 47, 283-289 (2015).
  15. Montero, E. F., Quireze, C., d'Oliveira, D. M. Bile duct exclusion from selective vascular inflow occlusion in rat liver: role of ischemic preconditioning and N-acetylcysteine on hepatic reperfusion injury. Transplant Proc. 37, 425-427 (2005).
  16. Tártaro, R. D., et al. No protective function found in Wistar rats submitted to long ischemia time and reperfusion after intermittent clamping of the total hepatic pedicle. Transplant Proc. 47, 1038-1041 (2015).
  17. Yeh, D. Y., Yang, Y. C., Wang, J. J. Hepatic Warm Ischemia-Reperfusion-Induced Increase in Pulmonary Capillary Filtration Is Ameliorated by Administration of a Multidrug Resistance-Associated Protein 1 Inhibitor and Leukotriene D4 Antagonist (MK-571) Through Reducing Neutrophil Infiltration and Pulmonary Inflammation and Oxidative Stress in Rats. Transplant Proc. 47, 1087-1091 (2015).
  18. Kilicoglu, B., et al. Ultrastructural view of a promising anti TNF-α agent on hepatic ischaemia reperfusion injury. Bratisl Lek Listy. 601-607 (2015).
  19. Jiménez Pérez, J. C., et al. Spironolactone Effect in Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury in Wistar Rats. Oxid Med Cell Longev. 3196431 (2016).
  20. Sano, N., et al. New drug delivery system for liver sinusoidal endothelial cells for ischemia-reperfusion injury. World J Gastroenterol. 21, 12778-12786 (2015).
  21. Chang, Y. K., Huang, S. C., Kao, M. C., Huang, C. J. Cepharanthine alleviates liver injury in a rodent model of limb ischemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol Taiwan. (2015).
  22. Lucas, M. L., Rhoden, C. R., Rhoden, E. L., Zettler, C. G., Mattos, A. A. Effects of L-arginine and L-NAME on ischemia-reperfusion in rat liver. Acta Cir Bras. 30, 345-352 (2015).
  23. Yeh, D. Y., Tung, S. P., Fu, Y. H., Yang, Y. C., Wang, J. J. Intravenous superoxide dismutase administration reduces contralateral lung injury induced by unilateral lung ischemia and reperfusion in rats through suppression of activity and protein expression of matrix metalloproteases. Transplant Proc. 47, 1083-1086 (2015).
  24. Yusen, R. D., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second Official Adult Lung and Heart-Lung Transplantation Report-2015; Focus Theme: Early Graft Failure. J Heart Lung Transplant. 34, 1264-1277 (2015).
  25. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. http://www.biotek.com/assets/tech_resources/ROS%20White%20Paper.pdf 1-14 (2012).
  26. Gaweł, S., Wardas, M., Niedworok, E., Wardas, P. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad Lek. 57, 453-455 (2004).
  27. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263, 6884-6892 (1988).
  28. Carlberg, I., Mannervik, B. Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490 (1985).
  29. Nguyen, W. D., Kim, D. H., Alam, H. B., Provido, H. S., Kirkpatrick, J. R. Polyethylene glycol-superoxide dismutase inhibits lipid peroxidation in hepatic ischemia/reperfusion injury. Crit Care. 3, 127-130 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics