Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

Immunology and Infection

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Summary

Analyse der Tränenfilm hilft Zytokine in verschiedene augenfällige Krankheiten zu studieren. Wulst basierte Multiplex-Assays sind einfach und empfindlich und ermöglichen das Testen von mehreren Zielen in Proben mit kleinen Volumina. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Tear Film Zytokin Profilierung eines mit Wulst basierte Multiplex-Assays.

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Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

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Abstract

Tränenfilm ist ein komplexes Gemisch von Lipiden, Proteinen und Mineralien umfasst die äußere Oberfläche des Auges, wodurch Schmierung, Ernährung und Schutz für die darunter liegenden Zellen. Analyse der Tränen ist eine aufstrebende Gegend für die Identifizierung von Biomarkern für die Vorhersage, Diagnose und Prognose von verschiedenen augenfälligen Krankheiten. Tränen sind leicht zugänglich und ihre Sammlung ist nicht-invasiv. Daher sind fortschreitende Technologien zur Identifikation von mehreren Analyten in Tränen, Veränderungen im Protein oder Metaboliten Zusammensetzung und seine Verbindung mit pathologischen Bedingungen studieren gewinnt an Bedeutung. Träne Zytokine sind ideale Biomarker für die Gesundheit der Augenoberfläche zu studieren und auch in das Verständnis der Mechanismen von verschiedenen augenfälligen Oberfläche Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit und vernal Konjunktivitis helfen. Wulst basierte Multiplex-Assays sind in der Lage mehrere Analyten in einer kleinen Menge der Probe mit einer höheren Empfindlichkeit zu erkennen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll der Träne Musterkollektion, Extraktion und Analyse des Cytokine profiling eine Perle mit Multiplex-Assays basieren.

Introduction

Tränen sind von der Tränendrüse und Zubehör Drüsen produziert und die äußere Oberfläche des Auges zu beschichten. Tränenfilm besteht aus einer äußeren Lipidschicht und einer inneren wässrigen Schicht, die lösliche Proteine enthält, Schleimstoffe und Membran gebunden Schleimstoffe. Tränen verhindern mikrobielle Invasion, Nährstoffe liefern und bieten Schmierung an der Augenoberfläche. Tränen fungieren als Schnittstelle zwischen der Luft und Gewebe für den Sauerstofftransport in die Hornhaut. 1 die Tränenfilm besteht aus Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden und Elektrolyte. Die Zuordnung zwischen Träne Proteine mit Okular und systemische Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit, vernal Konjunktivitis, Glaukom, Diabetes Mellitus, Schilddrüsen-assoziierten Orbitopathy und Krebs wurde in mehreren Studien identifiziert. 2 , 3 , Träne fließen Streifen (Schirmer Streifen) oder 4 Träne Proben können durch Microcapillary Rohre erfasst werden. Darüber hinaus ist der Schirmer-Test ein Standardverfahren durchgeführt in der Hornhaut und refraktive Chirurgie Kliniken, deren, die Ergebnisse für Zytokin Analyse Assays verwendet werden können. Nicht-invasive Probenentnahme, Zugänglichkeit der Bio-Probe und der Verband der Träne Komposition mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen machen Film eine potentielle Quelle von Biomarkern für verschiedene augenfällige und systemische Krankheiten reißen. 4 , 5 , 6

Träne Zytokine spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der okulären Oberfläche Gesundheit und entzündlichen Erkrankungen der verschiedenen augenfälligen Krankheiten. 7 abnorme Konzentrationen von verschiedenen Zytokinen in Träne Proben wurden berichtet, mit trockenen Augen, vernal Keratokonjunktivitis (VKC), atopische Keratokonjunktivitis (AKC), saisonale allergische Konjunktivitis und Uveitis einhergehen. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Träne Proteine können von den traditionellen Methoden wie Massenspektrometrie, westliche Beflecken und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) analysiert werden. 14 , 15 sind jedoch die Grenzen dieser Methoden, schlechte Empfindlichkeit und ein größeres Volumen der Probe für die Analyse von mehreren Träne Zytokinen bei jedem Patienten erforderlich. 16 , 17 Bead basierte Multiplex-Assays wurden entwickelt, um mehrere Analyten in komplexen Mischung Proben analysieren und erfolgreich auf Träne Proben analysieren mehrere Zytokine bei verschiedenen Krankheiten angewendet. 6 , 18 A Kombination der Sandwich ELISA und Flow Cytometry Techniken ermöglichen diese Tests zu empfindlicher als ELISA für die Quantifizierung von mehreren Analyten in einer einzigen Probe. 19 diese Methode kann auf einer Vielzahl von klinischen Proben und Zelle Kultur Überstände und hilft bei der Untersuchung von Immunantworten in mehreren pathophysiologischen Bedingungen angewendet werden. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Es gibt mehrere Studien vergleichen Wulst basierte Multiplex mit ELISA Tests und haben eine Korrelation zwischen den Methoden berichtet. Loo Et Al. verglichen Wulst Multiplex-Assays mit konventionellen ELISA zum Nachweis von Adiponectin, resistin, Leptin und Ghrelin im menschlichen Serum bzw. Plasma-Proben und eine starke Korrelation (R > 0,9) zwischen der Assays. 25 Dupont Et Al. berichteten eine starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ und TNF-α in Phytohemagglutinin und Lipopolysaccharid angeregt Vollblut gesammelt von schwangeren Frauen. 26 Pickering Et Al. berichteten eine weitere starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Serum-Antikörper gegen Haemophilus Influenza Typ B Polysaccharid (R = 0.96), Kombinationsimpfung von Clostridium Tetani (R = 0.96), und Corynebacterium Diphtheriae (R = 0,91). 27 Biagini Et Al. berichteten eine hohe positive Korrelation (R = 0.852) zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Bacillus Anthracis Anti-PA IgG in Serumproben. 28 Wang Et Al. berichteten eine Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit Biomarker Amyloid-β 42 (R = 0.77), total Tau (R = 0,94), und Tau auf Aminosäure 181 phosphoryliert (R = 0,82) in Liquor cerebrospinalis Proben. 29 diese Studien haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit der Wulst Multiplex-Assays anhand verschiedener klinischen Proben, kleinere Probe Volumenanforderungen und eine Korrelation mit standard ELISA, die Perle basierte Multiplex-Assays eine vielversprechende machen Alternative zu traditionellen ELISA-Methoden zum Nachweis von mehreren Analyten in der unterschiedlichen Art der Proben in verschiedenen Krankheit Phänotypen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für Perle basierte Multiplex-Assay für die Cytokine Profilerstellung für 41 Analyten in Träne Proben von gesunden Probanden mit Schirmer Streifen.

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Protocol

in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden von den institutionellen Fachkollegiat Tan Tock Seng Krankenhaus, Singapur genehmigt.

1. reißen Cytokine Analyse

  1. Sammlung von Tränen:
    1. bitten, das Thema sitzen bequem auf einem Untersuchungsstuhl und seinen/ihren Kopf gegen die Kopfstütze.
    2. Bitte das Thema zum Nachschlagen, vorsichtig öffnen die Schirmer-Streifen (aus Filterpapier Whatman Nr. 41) und legen Sie das abgerundete Ende des Streifens auf der unteren Fornix des Auges und anweisen, das Thema zu schließen Sie die Augen für 5 min. Beim Sammeln der Tränen sorgsam um okuläre Kontaktfläche zu minimieren. 30
    3. bitten, das Thema seiner/ihrer Augen zu entfernen und legen Sie sie in einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu öffnen. Labor oder bei-80 o C das Rohr bis zum Testen für die Profilerstellung Zytokin Sofortüberweisung.
  2. Elution von Tear-Beispiel vom Fluss Aufreißfaden:
    1. schneiden dem Aufreißfaden Fluss auf einer Länge von 0,5 cm (um die Menge der Tränen zu prüfenden standardisieren) und legen Sie sie in einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    2. Fügen Sie 30 µL Puffer assay und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, gefolgt von der Röhre bei 14.000 x g für 1 min. Zentrifugieren
    3. Übertragung den Überstand in ein anderes 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und entsorgen Sie den Streifen. Legen Sie die Probe mit der Röhre auf dem Eis und der eluierten Tear-Beispiel sofort nutzen, für die Profilerstellung Zytokin.
  3. Vorbereitung der Reagenzien:
    Hinweis: einundvierzig Analyten in jeder Stichprobe von Perle basierte Multiplex-Assay getestet werden sind Interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, Interferon-Alpha (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-Gamma-induzierbaren Protein 10 (IP-10, CXCL10), Makrophagen abgeleitete Chemokin (MDC), Makrophagen entzündliche Protein (MIP)-1α und MIP-1β Monocyte chemotaktische Protein (MCP)-1, MCP-3, Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α), TNF-β, Wachstum reguliert Onkogen (GRO), Tumor-Wachstum Faktor-Alpha (TGF-α), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF)-2, Thrombozytenzahl abgeleitet Wachstumsfaktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF), Eotaxin, Fractalkine, löslicher CD40 Ligand (sCD40L), Fms-Like Tyrosin-Kinase 3 Liganden (Flt - 3L) und reguliert bei Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert Protein (RANTES).
    1. Den Antikörper Wulst Lösung (50 X) Fläschchen auf Raumtemperatur (20-25 o C) und Wirbel bringen die Fläschchen für 1 min.
    2. Die Anzahl der Brunnen zum Test erforderlich, und berechnen Sie die Menge der insgesamt Bead cocktail Antikörperlösung (25 µL pro Well) und jede Perle Antikörperlösung (50 X) erforderlich für den Assay.
    3. Cocktail Lösung zubereiten, indem Sie die gewünschte Endvolumen durch Hinzufügen den Restbetrag der Wulst Verdünnungsmittel den berechneten Betrag der einzelnen Perle Antikörperlösung und Füllung hinzufügen. Sicherstellen Sie, dass die letztendliche Konzentration an jeder Antikörper in der Cocktail 1 X. Bereiten Sie immer mindestens 20 % extra Volumen cocktail Lösung Pipettieren Fehlerfällen.
      Hinweis: Als Beispiel für eine 96-Well-Assay bereiten 3000 µL Antikörperlösung Bead cocktail. Die erforderliche Menge an jeder Perle Antikörperlösung = 3000/Lager Konzentration der jeweiligen Antikörper-Perle-Lösung; 3000/50 = 60 µL jeder Perle Antikörperlösung
      1. Hinzufügen 60 µL der einzelnen 41 Antikörper-Perle-Lösungen (60 X 41 = 2460 µL) zu einem Cocktail Flasche und die Antikörper Perle Mischung zu 3000 µL Finale 540 µL Wulst Verdünnungsmittel Lösung hinzufügen funktionierende Lösung (1 X).
      2. Vor dem Gebrauch, mischen Sie die Wulst cocktail Lösung richtig. Nachdem der Test speichern das restliche Volumen bei 2 – 8 o C für bis zu 30 Tage.
    4. Bereiten die Qualitätskontrolle (QC) durch QC 1 und QC 2 Aktien 250 µL deionisiertes Wasser hinzufügen.
    5. Mix richtig durch Umkehrung der Flaschen mehrmals und Vortex für 10 S. Transfer die Lösung ordnungsgemäß beschriftet Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen und speichern die restliche Lösung bei-20 ° C bis zu 30 Tage lang nutzbar.
    6. Vorbereitung der Waschpuffer durch Zugabe von 270 mL entionisiertem Wasser auf 30 mL 10 X waschen Pufferlösung und gut mischen (vor Verdünnung, 10 X Puffer auf Raumtemperatur bringen und lösen alle Salz Ausscheidungen durch Mischen). Speichern Sie die ungenutzten Waschpuffer (1 X) bei 2 bis 8 ° C, was bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.
    7. Bereiten die menschliche Zytokin standard Lager (10.000 Pg/mL alle Analyten) indem Sie das Lager Fläschchen 250 µL deionisiertes Wasser hinzufügen. Mischung gut durch invertieren mehrmals und Wirbel das Fläschchen für 10 s. lassen Sie es stehen für 10 min und übertragen der Vorratslösung zu Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen ordnungsgemäß beschriftet. Nach der Probe, speichern die restliche Lösung bei-20 ° C, die bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.
    8. Bereiten menschlichen Zytokin Arbeitsstandards durch 5-fold Verdünnungsreihen (50 µL - > 200 µL) mit Testpuffer zu 2000, 400, 80, 16 und 3.2 Pg/mL.
    9. Nach standard Vorbereitung nutzen die Arbeitsstandards innerhalb von 60 min und den Assay-Puffer als Rohling/Hintergrund verwenden (-Pg/mL).
  4. Zytokin Profilierung durch Wulst Multiplex-Assays basieren:
    1. bringen alle Reagenzien auf Raumtemperatur und Wirbel für 5-10 Sekunden vor der Aufnahme in die 96-Well Mikrotiterplatte. Wenn eluierten Träne Proben bei-80 gelagert sind o C vor der Assay die gefrorene Träne Extrakte auf Eis auftauen und Zentrifugieren bei 1000 X g für 5 min.
    2. Bereiten ein Assay-Arbeitsblatt in eine vertikale Konfiguration für menschliche Zytokin-Normen arbeiten [0 (leer), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 und 10.000 Pg/mL], QC1, DC2 und Samples.
    3. Fügen Sie 200 µL 1 X Waschpuffer an jeden der Platte gut, versiegeln Sie es mit Platte Versiegelung und halten Sie es auf einem Teller Schüttler bei Raumtemperatur (20-25 o C) für 10 min.
    4. Dekantieren der 1 X Waschpuffer durch die Platte umdrehen und tippen sie auf saugfähige Handtücher mehrmals, um die Restmenge Waschpuffer in den Brunnen zu entfernen.
    5. Fügen Sie 25 µL jeder Arbeit menschliche Zytokin standard, QC1, DC2, leer (Testpuffer) und Proben in die entsprechenden Vertiefungen.
    6. Fügen Sie 25 µL Testpuffer in jede Vertiefung.
    7. Fügen Sie 25 µL 1 X Bead cocktail Antikörperlösung in jede Vertiefung. Wie Perle Antikörperlösung lichtempfindlich ist, die Dichtplatte mit Platte Versiegelung und bedecken Sie es mit Alu-Folie zum Schutz vor Licht während des Tests.
    8. Brüten die Platte bei 4 o C über Nacht auf einem Schüttler.
    9. Legen die Platte auf die Tellerhalter eine automatische Magnetplatte Unterlegscheibe. Lassen Sie es für 1 min die magnetische Beads an der Unterseite des Brunnens zu begleichen und aspirieren gut Inhalt. 200 µL Waschpuffer pro Bohrloch und lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Nochmals die Wäsche (waschen, folgen Sie der Hersteller ' s Anweisungen).
    10. Hinzufügen 25 µL Erkennung Antikörper-Lösung in jedem gut, der Dichtplatte, mit Alufolie bedecken und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min auf einem Schüttler.
    11. Fügen Sie 25 µL Streptavidin-Phycoerythrin Lösung in jede Vertiefung der Dichtplatte, mit Alufolie bedecken und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min auf einen Shaker.
    12. Legen Sie die Platte auf einer Magnetplatte Unterlegscheibe. Lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Fügen Sie 200 µL Waschpuffer pro Bohrloch. Lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Die Wäsche noch einmal zu wiederholen.
    13. Hinzufügen 150 µL Scheide Flüssigkeit jeweils gut und legen Sie die Platte auf einen Shaker für 5 min bei Raumtemperatur, die Antikörper-Perlen Aufschwemmen.
    14. Die Platte sofort mit der Wulst Multiplex-Assays Platte Leser basierend lesen und analysieren die Zytokin-Konzentrationen mit einem 5-Parameter Kurvenanpassung Algorithmus. Eine schematische Flussdiagramm des Risses Zytokin profiling ist in Abbildung 1 dargestellte.
  5. Assay Platte (Instrument einrichten) und Datenanalyse zu lesen:
    1. Switch auf den Wulst basierte Leser Multiplex-Assays und Pre-Warm der Laser für 30 min.
    2. Starten Sie die Wulst basierte Multiplex-Assay Software. Unter den ' automatisierte Wartung ' Registerkarte, wählen Sie die ' Kalibrierung-Überprüfung ' Option. Vortex jedes Reagens Fläschchen der Kalibrierung und Verifizierung Perlen für 30 s. Platz 5 Tropfen jedes Reagens in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Behälter mit entionisiertem Wasser und 70 % Ethanol.
    3. Erstellen ein neues Protokoll
      1. öffnen die ' Protokolle ' Seite und dann die ' Protokolle ' tab. Klick " schaffen neue ProtocolŔ die ' Einstellungen ' Registerkarte wird geöffnet.
      2. In den ' Namen ' box, geben Sie den Namen des Protokolls.
      3. Geben Sie eine Beschreibung in das Feld rechts neben der ' Name ' Box.
      4. In der ' Version ' geben Sie die Version des Protokolls.
      5. In der ' Hersteller ' geben Sie die Angaben des Herstellers für das Protokoll.
      6. Definieren Einstellungen in den ' Erwerb Einstellungen ' Abschnitt wie folgt. Set ' Volumen ': 100 µL ' Timeout ': 60 s; ' DD Gating ': 8.000 bis 15.000; ' Reporter Gain ': Standard PMT; ' Bead Art ': Magnetic Bead.
      7. Definieren Einstellungen in der ' Analyseeinstellungen ' Abschnitt, Auswahl ' Quantitative ' als Art der Analyse. Set ' Anzahl der Standards ': 6; ' Anzahl von Steuerelementen ': 0; Tick der ' bedeuten, repliziert der ' box;
        Tick der ' Analyse der Ergebnisse beim Erwerb von Proben ' Box.
      8. Klicken Sie " NextŔ die ' Analyten ' tab öffnet, klicken Sie auf den gewünschten Analyten (bead ID) im Raster nummerierten Analyt.
      9. Klicken und eingeben der entsprechenden Analyten zu nennen, in den ' Namen ' Spalte auf der rechten Seite des Rasters Analyten (Analyten ' Namen und deren entsprechenden Perle Region Details wurden in Tabelle 1 genannten).
      10. Klicken Sie auf und geben Sie die gewünschte Maßeinheit (z.B. Pg/mL) in die ' Einheiten ' Box auf der linken Seite des der ' gelten alle ' Taste. Klicken Sie dann auf " gelten alle ".
      11. Klicken und eingeben die gewünschten Wulst zählen für jeden Analyten (z.B. 50) in der ' Graf ' Feld. Klicken Sie auf " alle ".
      12. Klicken Sie auf
      13. " NextŔ die Platte Layout-Registerkarte wird geöffnet. Markieren Sie die Brunnen für die Normen und wählen Sie " 2 " unter Graf zu replizieren, und klicken Sie auf die " S " Schaltfläche "Standard". Wiederholen Sie diesen Schritt für den Hintergrund " B " und Proben " U " Brunnen.
      14. Klicken Sie " sparen ".
    4. Schaffen neue Standards/Kontrolle viel
      1. offen die ' Protokolle ' Seite, und dann die ' Standards & Steuerelemente ' tab. Klick " schaffen neue Standard/Kontrolle viel ".
      2. Öffnen der ' wählen Sie Protokoll ' Feld. Wählen Sie das Protokoll, das in Schritt 1.5.3 erstellt wurde.
      3. Geben Sie die Informationen der Normen entsprechend: Std/Ctrl-Kit Nummer, Std/Ctrl Set Name, Ablauf und Hersteller.
      4. Schlüssel den Wert auf höchstem Niveau für jeden Analyten (d. h. 10000 Pg/mL). Geben Sie 5 unter Verdünnung und klicken Sie auf " gelten alle " zum automatischen Generieren von der erwarteten Konzentrationen für den Rest der Normen.
      5. Klicken Sie " sparen ".
    5. Erstellen eine neue Charge von einem vorhandenen Protokoll
      1. offen die ' Chargen ' Seite und klicken Sie auf " eine neue Batch-Registerkarte aus einem vorhandenen Protokoll erstellen ".
      2. Geben Sie den Namen in der '-Blattname ' box und geben Sie eine Beschreibung über den Stapel in die ' geben Sie Optional eine Beschreibung ' Box.
      3. Klicken Sie auf das Protokoll generiert zuvor (im Schritt 1.5.3).
      4. Klicken Sie " NextŔ die nächste Registerkarte, die geöffnet wird ist der ' sexuell übertragbare Krankheiten & Ctrls ' tab. zeigt die Details der Assay-Standards und wählen Sie " nächste ".
      5. Auf die ' Platte Layout '-Register, weisen auch Befehle für diesen Stapel und " sparen " Stapelverarbeitungsinformationen speichern möchten die ' ausstehenden Batch ' Liste.
      6. Laden Sie die Platte in der Wulst basierte Multiplex-Assays Platte Leser, schütteln Sie sie für 5 min und die Stapelverarbeitung ausführen, aus der ausstehenden Batchliste. Erfassten Daten werden im CSV-Format gespeichert werden.
  6. Datenanalyse
    1. konvertieren die CSV-Datei in das .rbx (Ergebnisse-Datendatei) Dateiformat mit dem Rbx-Konvertierungs-Software aus der Perle basierte Multiplex-Assay Software generiert. Die Konvertierungs-Software zu starten, wählen Sie die CSV-Datei unter select xPONENT Datei(en) und klicken Sie auf die " erzeugen " Taste; die .rbx-Datei wird in der ausgewählten Ausgabe-Ordner gespeichert werden.
    2. Starten Sie die Analysesoftware und öffnen Sie die Datei .rbx.
    3. Optimieren die standard Kurven mit Hilfe der 4PL/5PL Kurvenanpassung.
      1. Wählen Sie Folgendes in die ' Standardkurve ' Registerkarte: ' Regression Typ ': ' Logistik-5PLƆ ' Achse Transformation ': ' Log(x) - Linear (y) Ɔ Tick der ' zeigen Conc Bereich Linien ' box, kreuzen Sie die ' zeigen unbekannt Proben ' box; Tick der ' zeigen Kontrollproben ' box; Tick der ' anwenden auf alle Analyten ' box; Tick der ' zeigen Bericht nach der Optimierung ' Box.
      2. Klicken Sie auf die " optimieren " Taste für die automatische Optimierung.
    4. Kennzeichnen die Probe Identitäten unter ' geben Sie Probe Info ' tab.
    5. Erhalten die beobachteten Konzentrationen in der ' Berichtstabelle ' Registerkarte, und klicken Sie auf " Berichtstabelle exportieren " zum Generieren der Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei zur weiteren Analyse.

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Representative Results

Träne Proben wurden von 8 Augen von 4 gesunden Probanden mit Aufreißstreifen Fluss gesammelt und Zytokin Ebenen wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls analysiert. Alle Probanden waren männlich und das Alter der vier Probanden betrug 36, 42, 44 und 52 Jahren beziehungsweise. Okuläre Oberfläche Gesundheit und trockenes Auge Krankheit wurde durch klinische Tests (Tear Film Pause, Zeit, Schirmer Test, Hornhaut Färbung, Bindehaut Färbung, Deckel/Meibom-Drüse-Prüfung, Hornhaut Träne visuellen Anzeichen und Symptome) nach bewertet die Trockenes Auge International Workshop, 2007 Leitlinien und keiner der Probanden zeigten keine Anzeichen und Symptome des trockenen Auges Krankheit. 31

Aus den 41 Zytokine analysiert wurden 31 Zytokine gefunden in allen Proben die Träne, TNF-α, IL-17A und MIP-1β erkannt wurden in 7 Augen 4 Fächer, IL-4 wurde in 6 Augen 4 Fächer, IFN-γ in 6 Augen 3 Fächer, IL-1A in 5 Augen der 3 Subj erkannt wurde erkannt wurde erkannt ECTS, Eotaxin und IL-9 wurden nachgewiesen in 3 Augen 2 Fächer, IL-3 in 1 Auge und MIP-1α in keiner der Proben festgestellt wurde. In Tabelle 2wurden die Mittelwert ± SD-Konzentrationen von 41 Zytokine entdeckt bei gesunden Probanden mit Wulst basierte Multiplex-Assays (Abbildung 2) erwähnt. Aus 41 Zytokine analysiert wurde IL-1ra zu hoch in den Proben mit dem Mittelwert ± SD von 203,9 ± 52.6 ng/mL exprimierenden gefunden und reichte von 129.64 ng/mL bis 271.7 ng/mL. Zytokine IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF und G-CSF wurden ebenfalls hoch in die Tränen von gesunden Probanden (ng/mL Mengen) ausgedrückt und die restlichen Zytokine wurden in Pg/mL Mengen (Tabelle 2) ausgedrückt. Die niedrigste gemessene Konzentration von Träne Zytokin TNF-α mit dem Mittelwert ± SD 27.25 ± 19,97 Pg/ml war und reichte von 10,75 Pg/mL bis 56.02 Pg/mL. In 31 Zytokine, die in den Proben erkannt wurden, keiner zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied in der Konzentration (p> 0,05) zwischen rechtem und linkem Auge von t-Test (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Flussdiagramm des Risses Zytokin profiling. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Cytokine Profile bei gesunden Menschen zu reißen. Vertreter Streudiagramm zeigt die Log Mittelwert ± SD Konzentrationen von 41 Zytokine im reißen Proben von gesunden Probanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Inter Auge Träne Cytokine Profil Unterschiede bei gesunden Probanden. Vertreter Streudiagramm zeigt keinen statistisch signifikanten Unterschied (p> 0,05) in Inter Auge mittlere Konzentrationen von 31 reißen Zytokine bei gesunden Probanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

S. Nr. Analyten Perle-region
1 EGF 12
2 FGF-2 13
3 Eotaxin 14
4 TGF-Α 15
5 G-CSF 18
6 FLT - 3L 19
7 GM-CSF 20
8 Fractalkine 21
9 IFNΑ2 22
10 IFNΓ 25
11 GRO 26
12 IL-10 27
13 MCP-3 28
14 IL - 12P 40 29
15 MDC 30
16 IL - 12P 70 33
17 PDGF-AA 34
18 IL-13 35
19 PDGF-AB/BB 36
20 IL-15 37
21 sCD40L 38
22 IL-17A 39
23 IL-1RA 42
24 IL-1Α 44
25 IL-9 45
26 IL-1Β 46
27 IL-2 48
28 IL-3 51
29 IL-4 53
30 IL-5 55
31 IL-6 57
32 IL-7 61
33 IL-8 63
34 IP-10 65
35 MCP-1 67
36 MIP-1Α 72
37 MIP-1Β 73
38 RANTES 74
39 TNF 75
40 TNFΒ 76
41 VEGF 78

Tabelle 1: Analyten Namen und entsprechenden Perle Region Details.

S. Nr. Cytokine Anzahl der Augen Anzahl der Probanden Mittlere Konzentrationen SD
1 EGF 8 4 2610.29 1711.56
2 Eotaxin 3 2 404.73 260.76
3 FGF-2 8 4 827.73 262.44
4 FLT - 3L 8 4 475.4 133,6
5 Fractalkine 8 4 4179.08 1888.38
6 G-CSF 8 4 1287.57 633.16
7 GM-CSF 8 4 93.03 28.1
8 GRO 8 4 23176.87 18692.07
9 IFNa2 8 4 641.4 253.55
10 IFNg 6 3 76,6 42.81
11 IL-10 8 4 101.32 41.52
12 IL-12 p40 8 4 245.46 133.01
13 IL-12
P70 8 4 165.53 73.09 14 IL-13 8 4 685.84 272.92 15 IL-15 8 4 104,4 30,66 16 IL-17A 7 4 164.32 28.69 17 IL-1a 5 3 286.79 166.87 18 IL-1 b 8 4 63,98 18.29 19 IL-1ra 8 4 203892.58 52593.48 20 IL-2 8 4 78.35 25,15 21 IL-3 1 1 38.2 0 22 IL-4 6 4 268.94 120.84 23 IL-5 8 4 74.96 23.8 24 IL-6 8 4 86.97 27,78 25 IL-7 8 4 384.08 153.57 26 IL-8 8 4 3615.21 4677.5 27 IL-9 3 2 35,22 5.11 28 IP-10 8 4 87546.26 33256.53 29 MCP-1 8 4 10074.73 8205.5 30 MCP-3 8 4 376.13 120.68 31 MDC 8 4 968.08 309.39 32 MIP-1 b 7 4 199,72 84.79 33 PDGF-AA 8 4 5174.06 4103.97 34 PDGF-BB 8 4 2567.61 919.01 35 RANTES 8 4 742.41 457.57 36 TGF-a 8 4 407.82 339.12 37 TNFa 7 4 27,25 19,97 38 TNFb 8 4 124 24.16 39 VEGF 8 4 1601.2 776.85 40 sCD40L 8 4 932.1 509.27 41 MIP-1a 0 0 0 0

Tabelle 2: Reißen Cytokine Profile bei gesunden Probanden. Meine ± SD Konzentrationen von 41 Zytokinen bei gesunden Probanden mit Wulst basierte Multiplex-Assays erkannt.

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Discussion

Zytokine sind kleine zelluläre sekretierten Proteine und potente Immunmodulatoren Regulierung Immunantworten. 32 die Expressionsprofile von verschiedenen Zytokinen in Träne, die Proben sind im Zusammenhang mit verschiedenen pathologischen Zuständen des Auges und Studien über Cytokine Profile helfen zu verstehen, die Mechanismen der Pathogenese der Krankheit, den Zustand der okulären Gesundheit bestimmen, Schwere der Erkrankung, Diagnose und Verlauf. 2 , 5 untere Proteinkonzentrationen und kleinen Probenvolumina sind die größten Herausforderungen der traditionellen Methoden, Begrenzung der Nutzung des Tests wie ELISA für die Analyse der Träne Cytokine Profile. 33 Bead basierte Multiplex-Assays sind Immunoassays, die deutliche Vorteile gegenüber ELISA haben. Wulst basierte Multiplex-Assays erfordern kleinere Probenvolumina für die Analyse von mehreren Analyten und sind sehr empfindlich, Erkennung von Picogram Konzentrationen von Proteinen in biologischen Flüssigkeiten. 34

Hier berichten wir über ein standardisiertes Protokoll für die Quantitative Analyse von 41 Träne Zytokinen bei gesunden Menschen mit Wulst basierte Multiplex-Assays. Aus den 41 Zytokine im Bereich Perle basierte Multiplex-Assays 40 Zytokine in Träne Proben erkannt und konnte nicht erkennen, MIP-1α. Dieses negative Ergebnis könnte sein, denn es nicht nachweisbare Ebenen der MIP-1α in gesunden Träne Proben oder durch ein kleineres Volumen der Tränen gab. Träne Proben mit Schirmer Streifen haben einen Vorteil gegenüber anderen Methoden der Datenerhebung wie Microcapillary Rohr und Schwämme. Zum Beispiel in mehreren klinischen Bedingungen, Träne Flüssigkeitsvolumen gemessen werden durch Schirmer Streifen und die Träne Flüssigkeit eluiert aus dem gleichen Streifen nach der Messung und Zytokin-Analyse verwendet werden kann. 35 wenn Microcapillary Röhren routinemäßig verwendet werden, um Tränen zu sammeln und konsequenter Träne Profile zu produzieren, die Prozedur dauert länger als der Strip-Methode, ist langweiliger und für Kinder und andere Patienten unangenehm sein kann. Darüber hinaus kann diese Methode auch induzieren reflex Tränensekretion durch Berühren der Bindehaut und Variable zu Ergebnissen der Cytokine Profile im Vergleich zur basalen Tränen, was sich wiederum auf die Reproduzierbarkeit des Assays. 36 in einigen klinischen Bedingungen wie trockenes Augenkrankheit, Träne Musterkollektion von Schirmer Streifen ist zuverlässig für Proteinanalytik und hilft bei der Identifizierung von Biomarkern. 37 , 38

Wulst basierte Multiplex-Assays sind eine Kombination aus Durchflusszytometrie und Multiplex-ELISA in dem Analyten in der Probe zwischen der spezifischen Antikörper beschichtet und Farbe eingeklemmt sind codiert, magnetische Beads oder Mikrosphären und biotinylierte Detektionsantikörper. Diese komplexe können erkannt werden, indem die Reporter Molekül Streptavidin-Phycoerythrin (PE) konjugiert und nachfolgende Exposition zu einem dual Lasersystem in einem modifizierten Flow Cytometry-basierten Instrument. 39 in einem dual Lasersystem, ein Laser regt die interne Farbstoffe und sein Signal stellt die beschichteten spezifischen Antikörper. Der zweite Laser regt die Berichterstattung Molekül PE konjugiert komplexe Detektionsantikörper verpflichtet und die Intensität der Signale stellen die Konzentration des Analyten.

Die Fähigkeit die Mikrosphären mit Farbstoffen unterschiedlicher Intensitäten codiert werden ermöglichen die Probe um bis zu 100 verschiedene Analyten in einem kleinen Volumen der Probe in einem einzigen gut zu erkennen. 39 , obwohl Wulst basierend sind Multiplex-Assays, rapid, reproduzierbar und vergleichbar mit standard-ELISA-Assays,34,40 , die diese Methode spezielle Instrumente erfordert Evaluation Kits und Standardisierung von Protokollen für verschiedenen biologischen Proben. 39 das Vorhandensein von Auto-Antikörpern in klinischen Proben kann die Perle basierte Multiplex-Ergebnisse beeinflussen. 34 , 39 für den routinemäßigen Einsatz von diese Assays im klinischen Umfeld empfiehlt es sich, die Test-Kits von einem bestimmten Hersteller zu verwenden. Die Empfindlichkeit, die Erkennung der absoluten Konzentrationen von Zytokinen und Reproduzierbarkeit wurde berichtet, mit den verschiedenen Kits variieren. 41 AntikörperMicroarrays oder Membran Microarrays sind sehr empfindlich, preiswerte alternative Hochdurchsatz Techniken, die mehrere Analyten in einem kleinen Volumen der Proben zu erkennen und erfolgreich angewendet werden können, auf reißen Proben für die Analyse von Zytokine und andere Proteine. 35 , 42 jedoch zahlreiche Einschränkungen bestehen, wie diese Tests sind zeitaufwendig, Semi-quantitative, weisen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und standardisierte Protokolle fehlen. 19 , 43

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben. Keine finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Forschungsarbeit wurde durch das Zentrum Zuschuss von Tan Tock Seng Krankenhaus personalisiert Seed Finanzierung Programm 2015 unterstützt. Singapur Eye Research Institute Pilot Grant und Tan Tock Seng Krankenhaus Stellplatz für Fonds gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

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