Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

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Summary

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

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Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

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Abstract

Das Ziel dieses Protokolls stellt eine optimierte Verfahren für die Reinigung und Pflege der pBECs und in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modelle basierend auf pBECs in Mono-Kultur (MC), MC mit Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), zu etablieren und berührungslose Kokulturen (NCC) mit Astrozyten von Schweinen oder Ratte Herkunft. pBECs waren isoliert und kultiviert aus Fragmenten der Kapillaren aus dem Gehirn Cortex von Hausschweinen ca. 5-6 Monate alt. Diese Fragmente wurden durch sorgfältige Entfernung der Hirnhaut, Isolation und Homogenisierung der grauen Substanz, Filtration, enzymatischen Verdauung und Zentrifugation gereinigt. Um weitere kontaminierende Zellen zu beseitigen, wurden die Kapillare Fragmente mit Puromycin-haltigen kultiviert Medium. Bei 60-95 % Zusammenfluss pBECs wächst aus der Kapillare Fragmente zu passagiert wurden durchlässige Membranfilter fügt und die Modelle gegründet. Um Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Phänotyp der pBECs zu erhöhen, wurden die Zellen mit folgenden Differenzierungsfaktoren behandelt: Membran permeationsfähigen 8-CPT-Zaatari (hier abgekürzt), Hydrocortison und ein Phosphodiesterase-Hemmer, RO-20-1724 (RO). Das Verfahren erfolgte über einen Zeitraum von 9-11 Tage, und bei der Festlegung der NCC-Modell waren die Astrozyten 2 bis 8 Wochen im Voraus kultiviert. Einhaltung der beschriebenen Verfahren des Protokolls ermöglichte die Errichtung der endothelialen Schichten mit stark eingeschränkter parazellulär Durchlässigkeit, mit NCC Modell zeigt einen durchschnittliche Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, und parazellulär Durchlässigkeit (Papp) für Luzifer gelb 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (meine ± SEM, n = 55). Weitere Auswertung dieser pBEC Phänotyp zeigte guten Ausdruck der engen Knoten Proteine Claudin 5, ZO-1, occludin und Adherens Junction Proteins p120-Catenin. Das vorgestellte Modell eignet sich für eine Vielzahl von Studien der BBB in Gesundheit und Krankheit, und mit der sehr restriktive parazellulär Durchlässigkeit, eignet sich dieses Modell für Studien von Verkehr und Handel mit intrazellulären.

Introduction

Zelluläre Struktur und Funktion der Blut - Hirn-Schranke

An der Schnittstelle von Herz-Kreislauf und zentrales Nervensystem (ZNS) wirkt die BBB als eine wichtige regulatorische Seite für Volumenstörungen Kontrolle über die CNS Mikroumgebung, was für einwandfreie Funktion und Schutz des Nervensystems unerlässlich ist. Die Website der BBB ist die Auskleidung der Blutgefäße Lumen Endothelzellen. Im Gehirn Kapillaren Endothelzellen bilden komplexe interzelluläre enge Kreuzungen und stark polarisierten Expressionsmuster von bestimmten Zustrom und Efflux-Transporter sorgen für hochspezifische molekularen Transport zwischen dem Blut und der Gehirn- 1. Die tragenden Teile der engen Kreuzung komplexe enthalten Proteine aus der Familie occludin und Claudin, Zonula Occludens (ZO) Proteine, Cingulin und verbundenen Knoten Adhäsionsmoleküle (JAMs). Claudin-5 ist besonders wichtig in der parazellulär Knoten Einschränkung. Induktion und Wartung von diesem charakteristischen BBB endotheliale Phänotyp beinhalten dynamische Wechselwirkungen mit umgebenden Zellen, einschließlich Perizyten, Astrozyten, Neuronen und die Keller-Membranen, die zusammen mit Gehirn endothelial Zellen Form der neurovaskuläre Einheit (NVU)2,3. Die Mechanismen dieser Interaktionen beteiligt sind noch nicht vollständig geklärt, aber gehören der chemischen Signale zwischen Zellen, die Modulation der BBB Permeabilität kurzfristig und langfristig BBB Funktionen4induziert. Vor allem Astrozyten sind dafür bekannt, zu dem Gehirn endothelial Zelle Phänotyp beitragen und sind eine Quelle von regulatorischen Faktoren wie Glia-derived Neurotrophic Factor (tritt bei intrazellulären cAMP)5, grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor-6, Hydrocortison7und transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β)8. Die Wirkung von TGF-β, wurde jedoch diskutierten9.

Von In Vivo , In Vitro BBB

In Vivo Studien weiterhin wertvolle Informationen über BBB Biologie. Zellmodelle Kultur können jedoch zusätzliche Einblicke und stellen nützliche Werkzeuge für detaillierte molekulare und funktionelle Aspekte der BBB in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl die komplexen Wechselwirkungen zwischen der Zelltypen und Bestandteile der BBB in in-vitro- Modelle vollends schwierig sind, gibt es seit, die erste Reinigung des Gehirn endothelial Zellen und Anwendung dieser in Mono-Kulturen 10 , 11 , 12, umfangreiche Entwicklung der Reinigung Verfahren und Wachstumsbedingungen der BBB Zell-Kultur-Modelle, wodurch größere Ähnlichkeit mit der in-Vivo -Barriere. Die häufig verwendete in-vitro- BBB-Modelle basieren auf Primärzellen Nagetier, Schweinen und Rindern Ursprungs und auf immortalisierte Zelllinien. Jedes Modell hat verschiedene vor- und Nachteile. Für Vergleich und Modell Wahl sind Validierung Markierungen wie Ausdruck der BBB-Enzyme, Transporter, Rezeptoren und Strukturproteinen verwendet, um Übersichten über die aktuellen Modelle1zu erstellen.

Ziel des Protokolls

Ein wichtiges Merkmal der BBB Barrier Dichtigkeit und hohe TEER, aber eine große Anzahl der verfügbaren Modelle spiegeln nicht gut in Vivo -Level. Integration von Entwicklung und Optimierung Beiträge von mehreren Labors, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode für den Aufbau eines hohen TEER in-vitro- BBB Modells basierend auf primäre pBECs in MC mit oder ohne ACM oder NCC mit primären präsentieren Astrozyten Ratte oder porcinen Ursprungs. Die dabei angewandten Verfahren und Etablierung des Modells gehören Bemühungen kontaminierende Zellen zu eliminieren und Differenzierung der pBECs in einem BBB-Phänotyp zu verbessern. Diese Arbeit führte zu die Einrichtung von zuverlässigen, TEER-Modelle mit niedrigen parazellulär Durchlässigkeit und gute funktionelle Expression des wichtigsten festen Knoten Proteine, Transporter und Rezeptoren. Wie die Astrozyten ein beitragender Faktor zum Gehirn endothelial Zelle Phänotypus, stellen die drei unterschiedlichen Bedingungen der Kultur jedoch drei unterschiedliche Phänotypen der Gehirn endothelial Zellen dar. Das NCC-Modell eignet sich speziell für Studien bestimmte spezielle Mechanismen in der Drogeentdeckung, Transportstudien und intrazellulären Menschenhandel, sowie für die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen wo ist maximale Ausdruck der BBB-Funktionen vorteilhaft.

Ursprung und Geschichte des Protokolls

Das hier beschriebene pBEC-Modell basiert weitgehend auf dem porcinen Modell Eisai Laboratories (London) entwickelt von Dr. Louise Morgan und Kollegen, ist anhand einer erfolgreichen früheren bovine Gehirn Endothelzellen Modell13. Die ursprüngliche Methode der Zelle Vorbereitung war eine zwei-Stufen-Filtration mit Nylon Maschen um den Mikrogefäßen, gefolgt von einem subculturing Schritt zur Verbesserung der Reinheit zu fangen. In der früheren Entwicklung der Methode wurden durch Zunahme der ergänzten Form, u. a. ACM optimale BBB Phänotyp und Barrier Dichtigkeit erreicht. Weitere Änderungen an der Methode wurden von R. Skinner Prof N. Rothwell Lab in Manchester UK14,15. Die Methode wurde von Abbott Labor, KCL London angenommen wo Patabendige es deutlich einfacher machte, durch den Verzicht von Astrozyten oder ACM und durch den Wegfall von kontaminierenden Zellen wie Perizyten mit Puromycin vorzubereiten. Die ersten Papiere bestätigt, dass das MC-Modell einige wichtige Merkmale des in Vivo BBB erhalten, einschließlich der effektiven engen Kreuzungen, Membran Verkehrssysteme und Rezeptor-vermittelten Transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. später S. Yusof wieder Astrozyten Kokultur getestet und fand es TEER, deutlich verbessert, so ist dies die bevorzugte Variante, die derzeit in der Abbott Labor21verwendet. Das Modell wurde erfolgreich übertragen, M. Nielsen Lab in Aarhus, wo weitere Änderungen wurden eingeführt (das Protokoll), einschließlich der Vereinfachung grau Rolle, Extraktion, mit nur einem Netz von Filtrationsschritt und einen einzelnen Filter Beschichtung Schritt Kombination von Kollagen und Fibronektin. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von porcinen Astrozyten (dieses Protokoll) beruhte auf Protokolle von T. Moos Labor in Aalborg, beschrieben von Thomsen Et al.22entwickelt. Der TEER und andere Eigenschaften des Modells erzeugt in London und Aarhus sind ähnlich, die verleiht Vertrauen auf den Begriff, den das Modell ohne weiteres zwischen Labors übertragen und reagiert gut auf die sorgfältige Beobachtung und Rationalisierung der Verfahrensschritte. In der Tat hat S. Yusof jetzt das MC-Modell in einem tropischen Land (Malaysia)23, die weitere Anpassung für die örtlichen Gegebenheiten und Gewebe Quellen beteiligt.

Vorteile gegenüber alternativen Methoden und derzeit etablierte Modelle

Im Vergleich zum Gehirn endothelial Zellen Nagetier und bovinen Ursprungs, bieten pBECs den Vorteil, dass eine niedrigere Rate des Verlustes der in Vivo BBB-Phänotyp nach Isolierung24. Darüber hinaus sind pBECs in der Lage, relativ enge endotheliale Barrieren zu bilden, auch wenn Sie in MC (800 Ω cm2)16 im Vergleich zu den häufigsten berichteten Kosten von Monolagen Zell-Linien wie bEND.5 und bEND.3 (50 Ω cm2) angebaut 25 , 26 , 27, dende (300-800 Ω cm2)28,29,30, und CerebEND (500 Ω cm2)29,31,32und primäre Gehirn endothelial Zellen der Maus (100-300 Ω cm2)SS = "Xref" > 33,34,35,36 und Ratte (100-300 Ω cm2)37,38. Allerdings hat der TEER Abhängigkeit auf die Reinigung und Kultur Verfahren dargestellt. In den meisten Fällen zeigt die Zugabe von ACM oder Kokultur mit Astrozyten differenzierende Wirkung auf die Endothelzellen und eine Erhöhung in Dichtigkeit der endothelialen Schichten1. Trotzdem, mit Bemühungen um die Kultivierung Bedingungen zu optimieren, nur die Rinder-basierte Modelle haben gezeigt TEER Werten vergleichbar mit der Schweine-basierte Modelle (Durchschnitt von 800 Ω cm2 MC, bis zu 2500 Ω cm2 in Astrozyten Kokultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Wie die Modelle basierend auf primäre bovine Gehirn haben endotheliale Zellen gezeigt große Unterschiede, sowohl zwischen als auch innerhalb von Laboratorien14,45,46,47,48, Reproduzierbarkeit könnte ein Problem sein. Im pBEC Modell hier berichtet haben der beteiligten Laboratorien mit geringer Variabilität, sowohl in als auch zwischen den Labors sehr ähnlich wie TEER und parazellulär Permeabilität Werte erreicht. Daher sollte es für andere Labors, ein robustes Modell mit geringer Variabilität, mit der hier vorgestellten Methode möglich. Neben enge endotheliale Schichten bilden, wurden Modelle mit pBECs vorher durch Expression von tight Junction-Proteine, funktionale BBB-Transporter, Rezeptoren und Enzymen und nachgewiesene Eignung für verschiedenste Studien15 validiert , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Außerdem unveröffentlichte Transkriptom-Daten auf die Ko-Kulturen von pBECs zeigt eine erwartete Profil der BBB-Transportern und Rezeptoren (unveröffentlichte Ergebnisse, Nielsen Et Al.).

Schweine-basiertes BBB-Modell hat einen weiteren Vorteil als Genom, Anatomie, Physiologie und Fortschreiten der Krankheit des Schweins reflektieren die Humanbiologie in höherem Maße als andere etablierte Modelle verfügt über60, die günstig sind für die pharmazeutischen Industrie. Da Schweine Gehirne gemeinsame Nebenprodukt der Fleischindustrie sind, bilden sie eine leicht zugängliche Quelle des Gehirns Endothelzellen, minimieren die Anzahl der Tiere für die Experimente benötigt, und bietet einen hohen Reinigung Ertrag aus einem porcinen Gehirn. Obwohl Reinigung und Pflege von Primärzellen ist etwas zeitaufwändig und erfordert Know-how für Standardisierung bei der Einrichtung des Modells, generieren Primärzellen die zuverlässigste BBB-Modelle. Immortalisierte Zelllinien können nicht Ersatz, als wichtige Eigenschaften sein, wie z. B. Barriere Engegefühl, Transporter Expressionsprofile und Mikroumgebung Verordnung nicht entsprechen die experimentelle Befunde in Vivo61, 62. in-vitro- Modelle bieten den Vorteil von live-Cell imaging mit höherer Auflösung, die Visualisierung von intrazellulären Prozessen ermöglichen dadurch, dass einen unmittelbarer Nähe Ansatz für die Stichproben oder beobachteten Zellen, mit Zielen mit höheren Vergrößerung und bessere optische Qualität63. Dies gilt nicht für die Verwendung von zwei-Photonen-Mikroskopie in lebenden Tieren. Des weiteren bieten in-vitro- Modelle die Möglichkeit, Zellen, erlaubt Visualisierung von tagged Proteine und Untersuchung ihrer Menschenhandel transfizieren.

Anwendungen des Modells

Die Funktion der BBB ist nicht festgelegt und kann dynamisch in Physiologie und Pathologie moduliert werden. Bei vielen neurologischen Krankheiten, einschließlich Neurodegenerative entzündliche und infektiöse Erkrankungen, Störungen und erhöhte Durchlässigkeit der BBB beobachtet64,65,66,67 . Um zu verringern und Fortschreiten der Krankheit und Folgeschäden zu verhindern, sind die Identifizierung und Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Modulation der BBB von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang zuverlässige in-vitro- Modelle sind in der hohen Nachfrage durch die pharmazeutische Industrie, und außerdem eine wichtige Rolle bei der Vorhersage des BBB Permeabilität von Drogen an die CNS. Jedes in-vitro- Modell als eine Durchlässigkeit Bildschirm sollte eine restriktive parazellulär Weg, eine physiologisch realistische Zellarchitektur und funktionelle Expression von Transporter Mechanismen68anzeigen. Zeigte, in früheren Studien16,17,57, und durch parazellulär Durchlässigkeit und Ausdruck der TJ und AJ Proteine hier das vorgestellte Modell erfüllt alle diese Kriterien und eignet sich für eine Reihe von BBB Studien in beiden normalen Physiologie und Pathologie. Die Stärken der die vorgestellte Methode der Reinigung und Pflege sind eine Kombination aus Einfachheit und Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, astrocytic zu beeinflussen, mit einem daraus resultierenden robust und zuverlässig hohe TEER in-vitro- BBB-Modell. Für diesen Zweck, Astrozyten von Schweinen und Ratte Ursprung haben gezeigt, dass die BBB-Phänotyp der pBECs in einer ähnlichen Art und Weise22ergänzen.

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Protocol

porcinen Gehirne wurden als Nebenprodukte der dänischen Lebensmittelindustrie erhalten. Dänischen Schlachthöfen sind unter strenger Überwachung und Beobachtung durch das dänische Ministerium für Umwelt und Lebensmittel.

Ratten für die Isolierung von Astrozyten verwendet wurden gezüchtet und in den lokalen Tierhaus bei einer Umgebungstemperatur von 22 ° C - 23 ° C und auf einem 12/12 h hell/dunkel-Zyklus unter Kontrolle des Tierarztes und nach Dänisch Gruppe untergebracht Vorschriften für Labortiere. Die Ratten wurden eingeschläfert, bevor sie nach internationalen Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren (Richtlinie Europäischen Gemeinschaften der 24. November 1986; 86/609/EWG) und dänische Richtlinien geopfert wurden. Keine in-Vivo-Experimente an Tieren oder menschlichen Material wurden in diesen Experimenten verwendet.

Hinweis: im folgenden ist ein pBEC wichtigsten Protokoll beschreiben (Schritt 1) Reinigung, Anbau (Schritt2) und (Schritt 3) TEER Messungen. Für die Einrichtung von NCC mit Astrozyten, eine Alternative Protcol (Schritt 4) beschreiben, Reinigung und Pflege von Ratten und Schweinen Astrozyten vorgestellt.

1. Reinigung von porcinen Gehirn Kapillaren

  1. 8-10 Gehirne von 5-6-Monate-alten Hausschweine (z.B. aus einem nahe gelegenen Schlachthof) sammeln und transportieren sie auf dem Eis ins Labor. Wir empfehlen die folgenden Reinigungsprozedur innerhalb 2-3 h nach Beendigung des Tieres ab.
  2. Die Köpfe in einer sterilen Fluss Bank legen und vorsichtig waschen mit PBS 1 L in ein Becherglas auf Eis gelegt
  3. Sorgfältig entfernen Hirnhaut aus einem Gehirn zu einem Zeitpunkt mit feinen Spitze Pinzette und übertragen die Hirnhaut-freie Köpfe auf einem anderen 1 L Becher mit PBS auf Eis gelegt. Verlängert die Verarbeitungszeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit für jedes Gehirn sollte 10-15 min.
  4. Mit einem Skalpell, abkratzen grauen Zellen aus einem Gehirn gleichzeitig und übertragen das isolierte Material auf Petrischalen (8,8 cm 2) mit 20 mL DMEM Nährstoff Gemisch f-12 (DMEM/F-12) auf Eis gelegt. Wie viel grauen Substanz wie möglich ohne Aberkennung der weißen Substanz Material isolieren. Durchlaufen Sie für erste Fragmentierung die grauen Zellen Material eine 50 mL Spritze ohne Nadel. Weiter um die Köpfe und die gesammelten grauen Material zu bündeln. Verlängert die Verarbeitungszeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit für jedes Gehirn sollte 10-15 min.
  5. Übertragung der isolierten grauen Material mit dem Schleifer-Rohr von einem Handheld Gewebe Homogenisator in einem Verhältnis von 50/50 mit DMEM/F-12 Medien. Das Material durch die 8 nach oben und unten Striche mit einem losen Stößel, gefolgt von 8 nach oben und unten Striche mit einem engen Stößel zu homogenisieren. Weiter bis alle isoliert Material homogenisiert worden, dann übertragen Sie das Homogenat auf eine 500-mL-Flasche und verdünnen mit DMEM/F-12 auf ca. 450 mL Gesamtvolumen.
  6. Filtern das Homogenat über eine 500-mL-blau-Cap-Flasche mit Filterhalter und 140 µm Filter-Mesh und Kapillaren zu isolieren, indem man das Gewebe durch den Filter. Verwenden Sie einen Filter pro 50 mL Homogenat und waschen Sie danach jeden Filter mit DMEM/F-12.
  7. Ort der Kapillare mit Filter in Petrischalen mit einem Aufschlusslösung Trypsin/EDTA (2,5 % Trypsin, 0,1 nM EDTA mit PBS-Puffer), Kollagenase CLS2 (2.000 U/mL) und DNase 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Verwenden Sie 1 Petrischale (8,8 cm 2, 20 mL Lösung) pro 3 Filter Netze.
  8. Legen Sie die Petrischalen bei 37 ° C für 1 h auf einem Orbitalschüttler mit 180 u/min oder rühren Sie sie vorsichtig alle 10 Minuten. Nach 1 h, die Kapillaren von den Filtern mit Suspension aus der Petrischale mit einer 1 mL-Pipette abwaschen.
  9. 2 50-mL-Tuben die Suspension aus 3 Platten aufgeteilt und die Verdauung zu stoppen, indem Sie 10 mL DMEM/F-12 zu je 50-mL-Tube.
  10. Der Zellsuspensionen Zentrifuge bei 250 X g, 4 ° C für 5 min. aspirieren Sie die Überstände und hängen Sie wieder jedes Pellet in 10 mL DMEM/F-12. Jedes Rohr eine weitere 20 mL DMEM/F12 hinzufügen. Wiederholen Sie diese Schritt, Zentrifuge zweimal.
  11. Lassen Sie die Röhren für 5 min auf Eis abgekühlt und übertragen Sie die Lösungen auf 2 neue 50 mL Röhrchen.
  12. Zellsuspensionen bei 250 X g, 4 ° C für 5 Minuten Zentrifugieren, und hängen Sie wieder jedes Pellet in 8-10 mL (ca. 1 mL/Gehirn verwendet) Einfrieren Lösung bestehend aus 10 % DMSO in FBS.
  13. Übertragen die Zellsuspension auf Cryovials, mit 1 mL pro Cryoröhrchen. Im Durchschnitt führt eine Reinigung 1 Fläschchen pro Gehirn verwendet, im Durchschnitt die Endothelzellen für 12-16 Einsätze. Legen Sie die Fläschchen in einer eisigen Box bei-80 ° C für mindestens 4 h bis zur Übernachtung. Danach die Cryovials in eine Cryotank mit flüssigem Stickstoff aufbewahren.
    Achtung: Flüssigstickstoff hat extrem niedrige Temperaturen. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen.

2. Anbau von primären pBECs (8-10 Tage)

  1. Ursprüngliche Kultur (3-5 Tage)
    Tag1
    1. die Voraussetzungen für die Befestigung der pBECs, Optimierung durchführen Beschichtung einer T75 Flasche durch Hinzufügen einer Lösung mit Finale Konzentrationen von Kollagen IV (150 µg/mL) und Fibronektin (50 µg/mL) in DdH 2 O in den Kolben, um sicherzustellen, dass die Lösung die ganze Oberfläche bedeckt. Verwenden Sie 10 mL für jedem T75 Kolben. Inkubation bei 37 ° C für 2 h
      Hinweis: Die Beschichtung kann kurz vor dem Einsatz oder bis zu einer Woche vor durchgeführt und mit PBS bei 4 ° c gelagert Die Beschichtung darf nicht austrocknen, oder es wird nicht mehr eine geeignete Anlage und Wachstum Oberfläche bilden.
    2. PBEC Wachstum vorbereiten 16 mL Medium bestehend aus DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % Plasma gewonnenen Serum (PDS), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Heparin (15 U/mL). Ergänzen Sie das Medium mit Puromycin (4 µg/mL) für endothelial Zellen auswählen. Beachten Sie, dass die Puromycin-Behandlung nur für maximal 5 Tage verwendet werden kann.
    3. Aliquot das vorbereitete Medium in 6 mL und 10 mL Volumen in zwei 15 mL-Tuben.
    4. Bringen Sie ein Fläschchen mit Kapillaren von flüssigem Stickstoff (Schritt 1.13) und tauen die Kapillaren durch Verwendung von 37 ° C Wasserbad oder durch Hinzufügen von 750 µL des Mediums vorbereitet von der 6-mL-aliquoten. Wenn Auftauen durch Zugabe von Medium, pipette vorsichtig rauf und runter zu tauen und die Aussetzung zu homogenisieren. Wenn aufgetaut, übertragen die Zellsuspension auf 6 mL Medium aliquoten.
    5. Entfernen Sie Einfrieren Medium spin die Kapillaren unten 250 X g, 4 ° C für mind. 7
    6. Vorsichtig Aspirieren den Überstand und erneut das Pellet in 1-2 mL 10-mL-aliquoten auszusetzen. Wenn wieder ausgesetzt, die Lösung 10mL Medium aliquoten übertragen.
    7. Übertragen die Kapillare Suspension in den beschichteten T75 Kolben und sanft neigen Sie die Flasche um gleichmäßige Verteilung über der Oberfläche zu gewährleisten. Legen Sie den T75 Kolben bei 37 ° C, 5 % CO 2.
      Tag 2
    8. Nach der Inkubation über Nacht 10 mL pBEC Wachstumsmedium ergänzt mit Puromycin (4 µg/mL) für eine T75 Kolben vorbereiten und durchführen eine mittlere Änderung. Beachten Sie, dass alle mittlere Lösungen auf Zellen angewendete vorgewärmt auf 37 ° C vor dem Gebrauch sein sollten.
      Hinweis: Alternativ kann eine mittlere Änderung sein durchgeführten 4-6 h Post-Beschichtung bei der Kapillaren auf der Oberfläche angebracht haben sollte. Inkubieren Sie die Zellen bis 60-95 % Zusammenfluss, in der Regel 3-5 Tage vom Auftauen erreicht ist. Tun nicht allow Zellen erreichen 100 % Zusammenfluss Vermeidung von Kontakt-Hemmung, die stoppen, können weitere Zellwachstum.
      Tag 4-6
    9. Wenn die gewünschte Konfluenz erreicht ist, Durchgang der Endothelzellen, durchlässige Membran Einsätze (siehe Abschnitt 2.2). Wenn die gewünschte Konfluenz am 4. Tag nicht erreicht wird, erfolgt die Medienwechsel. Spätestens am 6. Tag sollten Zellen an die durchlässige Membran Einsätze passagiert. Wenn die erforderliche Konfluenz von Tag 6 nicht erreicht wird, die Zellen sind nicht geeignet für Versuchszwecke.
      Hinweis: Vorbereitung der Astrozyten für NCC: beim Einrichten der Kokultur Modell, 2 - 8 Wochen alten Astrozyten in Kultur (siehe Abschnitt 4) sollten vorbereitet sein Kokultur Modell durch eine mittlere Änderung am Vortag Passagierung Endothelzellen auf Einsätze durchführen. Für jede Astrozyten vorzubereiten, 1500 µL Astrozyten Wachstumsmedium bestehend aus DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL) und führen Sie dann die mittlere Änderung.
  2. Wachstum von pBECs auf durchlässige Membran fügt (5 Tage)
    Tag 4-6
    1. Prepare durchlässige Membran Einsätze (12-Well-Platte mit Einsätzen von 1,12 cm 2 Fläche, 0,4 µm-Poren) für Aussaat von pBEC durch die Beschichtung mit Kollagen IV (500 µg/mL) und Fibronektin (100 µg/mL) in DdH 2 O. Einsatz ca. 300 µL für jede einfügen, und stellen Sie sicher, dass die Lösung der wachsenden vollflächig abdeckt. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ein Minimum von 2 h.
    2. 30 mL pBEC Wachstumsmedium vorbereiten (Medienkomposition, finden Sie in Abschnitt 2.1.2) ohne Puromycin.
    3. Aspirieren von pBEC Kultur in T75 Kolben Mittel- und sanft waschen zweimal mit 5 mL sterilem PBS bei Raumtemperatur.
    4. Trypsinize der Zellen durch Zugabe von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung (2,5 % Trypsin, 0,1 nM EDTA mit PBS-Puffer), T75, und legen Sie die Flasche bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ca. 5-7 min.
    5. Die Gehirn endothelial Zellen zu trennen, tippen Sie sanft auf der Seite des Kolbens mit den Fingerspitzen, schließlich verlassen Überlebende und stärkere Befestigung Perizyten auf der Oberfläche der Küvette T75. Visuell Ablösung unter dem Mikroskop zu untersuchen. Wenn 80 % Distanz beobachtet wird, nicht mehr Trypsinization durch Zugabe von 5 mL Medium.
    6. Übertragen die Zelle-Lösung auf eine 15 mL-Tube mit 10 mL-Pipette und Spin die Gehirn endothelial Zellen durch Zentrifugation bei 250 X g, 4 ° C für 7 Minuten.
    7. Sorgfältig entfernen den Überstand und das Pellet in 1mL Medium Aufschwemmen. Wenn angehalten, fügen Sie eine weitere 2 mL Medium bringen das Gesamtvolumen auf 3 mL
    8. die Anzahl der Zellen manuell mittels einer Zelle zählen Kammer oder eine automatische Zelle Zählsystem. Bereiten Sie eine Zelle Lösung von 2,2 x 10 5 Zellen/mL Medium, was zu einer endgültigen Aussaatdichte von 1,1 x 10 5 Zellen/einfügen.
    9. Die durchlässige Membran Einsätze Beschichtungslösung entnehmen und 500 µL Zellsuspension auf jeder Einsatz übertragen. Auf einem der Einsätze, fügen Sie nur Medium und verwenden diese Einlage als eine ' filtern nur ' Kontrolle für die TEER-Messungen.
    10. Stellen die Endothelzellen in MC, MC mit ACM, oder NCC mit Astrozyten in folgender Weise:
      1. für MC: fügen Sie 1500 µL pBEC Wachstum Mittel-/ACM pro Bohrloch 12-Well-Platte unter die durchlässige Membran-Einsätze. Legen Sie die durchlässige Membran-Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren Sie für 2 Tage.
      2. Für NCC: Transfer Einsätze zu Brunnen mit Astrozyten mit Astrozyten Wachstumsmedium aktualisiert am Vortag. Legen Sie die durchlässige Membran-Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren Sie für 2 Tage.
        Hinweis: Beachten Sie die Verwendung von verschiedenen Medien-Typen in den unteren Brunnen der drei Modelle.
        Tag 6-8
    11. Am 2. Tag, wechseln Sie das Medium auf die durchlässige Membran-Einsätze mit pBECs. Bereiten Sie 500 µL pBEC Wachstumsmedium pro einfügen, und sorgfältig durchführen der Änderung zur Minimierung von Störungen der Zellschicht. Zwei Tage inkubieren Sie die Zellen. Beachten Sie, dass der Medienwechsel auf Einsätze nur, und nicht auf unteren Brunnen durchgeführt wird.
  3. Stimulation mit Differenzierungsfaktoren (1-2 Tage)
    Tag 8-10
    1. für jede der verschiedenen Modelle, Stimulation Medien sollten wie folgt vorbereitet werden:
      1. für MC: für jede einfügen und bereiten nun, 500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
        MC: Bereiten Sie zusätzlich 1500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
        MC mit ACM: 1500 µL ACM Auftauen und ergänzen es mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
      2. Für NCC: für jeden Einsatz vorbereiten 500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM). Für jedes gut Astrozyten bereiten 1500 µL DMEM/F-12 ergänzt mit Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL), Heparin (15 U/mL), Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
    2. Für jede der verschiedenen Modelle, Datenträgeraustausch wie folgt durchführen:
      1. für MC: vorsichtig Aspirieren Medium aus Brunnen und Einsätze und beide Fächer mit 500 µL für jeden Einsatz die Differenzierung Medium hinzufügen und 1500 µL für jedes gut. Beachten Sie, dass Störungen auf beiden Seiten des Einsatzes der Zellschicht zu stören und beeinflussen kann.
      2. Für NCC: vorsichtig Aspirieren Medium aus Brunnen und 750 µL Differenzierung Medium pro Bohrloch hinzufügen. Vorsichtig aspirieren Sie Medium von Einsätzen und fügen Sie 500 µL Differenzierung Medium pro einfügen hinzu. Fügen Sie dann die restlichen 750 µL Differenzierung Medium zu jedem Astrozyten gut.
    3. Für alle Modelle: Legen Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren mit Differenzierung Medium bis zum nächsten Tag.
      Hinweis: Beachten Sie, dass für die NCC mit Astrozyten, Astrozyten ab diesem Zeitpunkt in serumfreien Medium gehalten sind.

3. TEER-Messungen

  1. am Tag nach anregende Zellen mit Differenzierung Medium, bereiten das Gewebe Widerstand Kammer Messsystem für TEER Messungen durch Spülen der Kammers zwei Mal mit DdH 2 O, einmal mit 70 % EtOH für 5 min und 2 weitere Male mit DdH 2 O.
  2. Der Gewebe Widerstand Messkammer 4 mL DMEM/F-12 hinzu, an das System anschließen und kalibrieren für ca. 30 min nach der folgenden Einstellungen: R = 0, Test R = 1000, Modus = R.
  3. Die TEER-Messungen durchführen, indem man sorgfältig die Einsätze in der Messkammer Gewebe Widerstand. Für jeden Einsatz, führen Sie Messungen in dreifacher Ausfertigung und berechnen Sie die durchschnittliche Ω cm 2.
    Hinweis: Für das Modell Kokultur TEER Werte werden voraussichtlich erreichen > 500 Ω cm 2. Wenn der entsprechende TEER nicht am ersten Tag zur Messung der TEER erreicht ist, fügen Sie neue Differenzierungsfaktoren (cAMP (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM)) und TEER wieder am folgenden Tag zu messen. Bei geeignete Ebenen erreicht werden, sollte das Modell bereit für das geplante Experiment. Beachten Sie, dass die Zellen für mindestens 3 h ruhen sollte, bevor Sie das Experiment für die Wiederherstellung nach TEER Messungen durchführen. Nach der Stimulation, TEER-Werte im allgemeinen bleiben akzeptabel für 24-48 h nach Stimulation.
    Hinweis: Eine alternative und schnellere Methode mit der starren STX - 100C-Elektrodenpaar auch zeichnet hohe TEER in diesem Modell 81. Das flexible STX2 eleCtrode paar gibt weniger zuverlässige Messwerte.

4. Vorbereitung von ASTROZYTEN für berührungslose KOKULTUR: Alternative Methode

  1. Reinigung der Astrozyten
    1. für jede Ratte Gehirn verwendet, Mantel 2 T75 Fläschchen durch Zugabe von 10 mL Poly-L-Lysin (5 µg/mL) in DdH 2 O zueinander T75 Kolben. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C für 30 min.
    2. Isolierung der Astrozyten kann wie folgt durchgeführt werden:
      1. Ratte Astrozyten:
        1. enthaupten 2 1 - 2 Tage alten Ratten mit einer anerkannten Methode.
        2. Schneiden Sie die Haut vor den Schädel vom Hals in Richtung Nase ab und schneiden Sie die Knochen mit einen sagittalen Schnitt.
        3. Mit gebogenen Pinzette den Schädel zu öffnen, nehmen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einer 15 mL Tube (Röhre 1) mit 11 mL DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL).
        4. Sorgfältig Hirnhaut mit feinen Spitze Pinzette zu entfernen und das Gehirn-Material mit einer 1-mL-Pipette aussetzen.
      2. Porcinen Astrozyten:
        1. erhalten 1 Gehirn aus einem 5-6-Monate-alten Hausschwein.
        2. Entfernen Sie vorsichtig aus dem Gehirn mit feinen Spitze Pinzetten und/oder Hände Hirnhaut.
        3. Sammeln 4 g graue Angelegenheit aus dem Gehirn und legen Sie die Stücke in 1-2 mL DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) in einer Petrischale. Wenn die Stücke groß sind, Hackfleisch mit Skalpell oder Zange.
        4. Unterbrechen das isolierte Material mit einer 1-mL-Pipette, verschieben Sie sie in eine 15-mL-Tube (Röhre 1) und füllen mit niedrigen Glukose DMEM mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) auf ein Gesamtvolumen von 11 mL ergänzt.
        5. Weiter Homogenisierung der isolierten Materials mit einer langen Nadel an einen 10-mL-Spritze befestigt und nach oben und unten 3 Mal aussetzen. Warten Sie, bis die großen Stücke in den Boden des Röhrchens niedergelassen haben, dann sammeln Sie 7 mL Medium von der Spitze des Schlauches (Rohres 1).
        6. Filter 7 mL Zellsuspension durch einen 40 µm-Nylon-Filter in eine neue 50-mL-Tube (Röhre 2).
        7. Hinzufügen 7 mL Medium Schlauch 1 mit dem Gehirn. Die Homogenisierung und Filtration von Schritte 4.1.2.2.5-6 fortgesetzt, bis das Volumen der gefilterten Zellsuspension in Rohr 2 ca. 35 mL ist.
    3. Die Beschichtungslösung aus den T75 Kolben [Schritt 4.1.1] zu entfernen. Eine schnelle Reinigung mit 5 mL PBS nach Inkubation mit Poly-L-Lysin kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen von giftigen Effekten von der Beschichtungslösung nicht geschädigt werden.
    4. Teilen und Samen isolierte Astrozyten Lösung gleichmäßig zwischen T75 Fläschchen. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO 2 für 3-5 Tage.
  2. Kultivierung Astrozyten und Vorbereitung NCC mit Endothelzellen (3 Wochen)
    1. Ursprüngliche Kultur
      1. nach 3-5 Tagen Inkubation, führen Sie eine mittlere Änderung durch sorgfältig Absaugen von Medium und Hinzufügen von 10 mL der niedrige Glukose DMEM mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) ergänzt.
        Hinweis: Nach der ersten mittlere Änderung Medium alle 5 Tage gewechselt werden. In den ersten 2 Wochen schütteln Sie die Fläschchen und waschen Sie die Zellen gründlich mit PBS, wenn das Medium wechseln. Dies hilft bei der Entfernung von kontaminierenden Mikroglia.
      2. Nach 3 Wochen des Anbaus die Zellen durch Zugabe von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung an der Unterseite von jedem T75 Kolben, trypsinize und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ca. 5-7 min.
      3. Trypsinization durch Zugabe von 5 mL Medium zu stoppen, die Zelle-Lösung für eine 15 mL Tube übertragen und Zentrifugieren der Astrozyten bei 250 X g, 4 ° C für 7 min.
      4. Sorgfältig überstand zu entfernen und wieder auszusetzen, die Zellen im eiskalten Lösung bestehend aus 10 % DMSO in FBS.
      5. Die Anzahl der Zellen und bereiten Sie eine Zelle Lösung von 4.0 x 10 6 Zellen/mL. Einfrieren der Zellen in Cryovials 1 mL pro Fläschchen hinzufügen.
    2. Wachstum in durchlässige Membran einfügen System unten Wells (2-12 Wochen)
      1. Wachstum der Astrozyten durch Zugabe von 1 mL der Poly-L-Lysin (5 µg/mL) in DdH 2 O in jede Vertiefung 12-Well Platten vorbereiten. Legen Sie die Platten bei 37 ° C für 2 h
      2. Vorbereitung jedes 12-Well-Platte, 25 mL von Astrozyten Wachstumsmedium (DMEM niedrige Glukose mit 10 % FBS und Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL) ergänzt).
      3. Bringen die Phiole der Astrozyten aus flüssigem Stickstoff und Auftauen der Zellen durch Zugabe von 750 µL DMEM niedrige Glukose Medium. Pipette vorsichtig rauf und runter zu tauen und die Aussetzung zu homogenisieren. Wenn aufgetaut, übertragen die Zellsuspension auf eine 15-mL-Tube und einem Volumen von 7 mL Medium hinzufügen.
        Achtung: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperaturen, so tragen Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe.
      4. Entfernen Sie Einfrieren Medium spin die Kapillaren unten 250 X g, 4 ° C für mind. 7
      5. Sorgfältig Aspirieren überstand und wieder auszusetzen, die Zellen im Medium.
      6. Entfernen Sie die Beschichtung aus den Brunnen der 12-well-Platten und die Zellsuspension in Vertiefungen mit 1 mL pro Bohrloch zu übertragen. Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2.
      7. Aktualisieren das Medium jeden dritten Tag und für mindestens 2 Wochen vor der Verwendung der Zellen für Kokultur mit Endothelzellen Kulturzellen. Die Zellen für Kokultur für bis zu 12 Wochen nach dem Auftauen mit dem optimalen Alter 2 bis 8 Wochen einsetzbar.

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Representative Results

Gründung der BBB In-vitro- Modelle

In der vorgestellten, optimierte Methode Anbau von pBECs und die Errichtung des durchlässige Membran einfügen mit MC oder ohne ACM oder NCC mit Astrozyten (Abbildung 1) für einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen (Abbildung 2) erfolgte. Für die Auswahl von Endothelzellen, wurde eine erste Kultur der gereinigten Kapillare Fragmente kombiniert mit Puromycin Behandlung für maximal 5 Tage, die meisten kontaminierende Zellen eliminiert und förderte das Wachstum von spindelförmigen Endothelzellen aus der Kapillare Fragmente (Abb. 3A-C). Am Tag 4-6 hatte pBECs zu einer Konfluenz von 60-95 %, wächst so nicht überlappende, Kontakt-gehemmt, längs ausgerichtete Zellen vermehrt. Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht hatten, wurden pBECs auf Kollagen IV und Fibronektin vergoldet beschichtet durchlässige Membran einfügen Filtermembranen (1,12 cm2 Fläche, 0,4 µm-Poren) bei einer Dichte von 1,1 x 105 Zellen/einfügen, die sie normalerweise gebildet konfluierende Monolagen nach 4 Tagen (Tag 8-10 post-Isolierung). Wenn pBECs Co Kultivierung, waren Astrozyten Ratte oder porcinen Ursprungs auf Poly-L-Lysin beschichtete Unterseite Brunnen für mindestens 2 Wochen vor Beginn der NCC (Abbildung 3D) überzogen. Bei der Festlegung der NCC hat gezeigt, dass Astrozyten für 2-8 Wochen kultiviert die beste Unterstützung bieten für die Förderung des BBB-Phänotyps in pBECs; innerhalb dieser Zeit bildeten die Astrozyten konfluierende Kulturen mit Zellen in einer wabenartigen Struktur (Abbildung 3E-F) angeordnet. Am 4. Tag in das durchlässige Membran einfügen Systemmodell (Tag 8 bis 10 Post Isolation), wurden Zellen mit Lager, Hydrocortison und RO zur Steigerung der Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Expressionsmuster von engen Knoten Proteinen, Transporter, stimuliert und Rezeptoren.

Charakterisierung von pBEC Phänotyp und parazellulär Durchlässigkeit

Visuelle Zelle Inspektion kombiniert mit TEER-Messung werden routinemäßig die zuverlässigsten Verfahren zur Beurteilung der Konfluenz und Dichtheit der Endothelzellen Schicht wachsen auf die durchlässige Membran Einsätze vor Experimenten. Abbildung 4 zeigt Ergebnisse von zwei Serien von Experimenten niedermolekularer Medikament Durchlässigkeit durch die BBB bewerten die Steuerungsparameter der TEER (reflektierende Ionischen Durchlässigkeit) kombiniert mit scheinbaren Permeabilität21 (P-app cm s-1) des radioaktiven Saccharose oder den Farbstoff Tracer Luzifer gelb (LY), reflektierende parazellulär Durchlässigkeit der typischen kleinen Wirkstoffmoleküle (~ 200-600 Da). Eine Verbindung von Interesse mit einer P-app größer als die P-app von Saccharose oder LY (je nach das Molekulargewicht des Medikaments) transzelluläre Durchlässigkeit und/oder Transport über die Zellen deuten könnte. Abbildung 4 zeigt, dass in durchlässige Membran mit pBECs oben Ratte Astrozyten, gute Chargen von pBEC kultiviert wird eingefügt (z. B. hier die LY festgelegt) generiert Helfern im Bereich 500-2000 Ω cm2, mit ein paar höher oder niedriger. Einige Chargen, vor allem in frühen Phasen des Lernens, des Protokolls möglicherweise niedrigerere Helfern rund um 100-900 Ω cm2 (z.B. hier die Saccharose festgelegt). TEER-Messung erlaubt die Auswahl von Filtern, zum Beispiel mit TEER ab > 500 Ω cm2, und über die Palette der TEER gezeigt, Papp ist relativ unabhängig von TEER, bezeichnend für eine ausreichend dicht Sperrschicht für diese Experimente. Das Protokoll zur Messung der Durchlässigkeit hängt von der Art des gelösten Stoffes/Konstrukt. Für eine Beschreibung des Verfahrens zur Messung der Durchlässigkeit der kleinen Moleküle im NCC beschreibt ein Protokoll Yusof, SR, et. Al-21. Auswertung der Ausdruck der engen Kreuzung Proteine in pBECs im NCC mit Ratte Astrozyten zeigte Lokalisierung von Claudin 5, occludin und ZO-1 entlang der Zell-Zell-Verbindungen, dargestellt durch Immunfluoreszenz (Abbildung 5A-C). Auch zeigte die Adherens Junction Proteins p120 Catenin klar definierte Verteilung entlang der Zell-Zell-Verbindungen (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der angewandten Modelle für in-vitro-BBB. Schematische Darstellung der durchlässige Membran Systemmodelle von pBECs in MC (A), MC mit ACM (B)und NCC mit Astrozyten (C)einfügen. Der MC pBEC Wachstum Mittel "oder" ACM galten in den unteren Brunnen, während in der NCC, Einsätze mit pBECs in Brunnen mit 2-8-Woche-alten Astrozyten gegeben wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Flussdiagramm der wichtigsten Schritte bei pBEC Anbau und die Einrichtung der vorgestellten Modelle. Für einen Überblick und eine Zeitleiste für die Methode fasst diese schematische Darstellung die wichtigsten Schritte in der Kultivierung Prozedur der pBECs und Einrichtung der vorgestellten Modelle, d. h. MC mit oder ohne ACM und NCC mit Astrozyten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative zeitlicher Verlauf der ersten Kulturen der pBECs und Ratte Astrozyten. Phase Kontrast Mikroskopie Bilder der Kulturen des pBECs (A-C) und Astrozyten (D-F) betrachtet über 5 Tage. Kapillare Fragmente am ersten Tag der ursprünglichen Kultur zeigte Präsenz von Kapillaren und kontaminierenden Zellen gereinigt (A, Tag 1(), welche nach mittlere Änderung am 2. Tag und ein weiterer Tag des Wachstums, zeigte Auswahl für pBECs, die Kapillare Fragmente ihres Wachstums ab (B, Tag 3(). Konfluierende Monolagen von pBECs in der Regel auf Tag 4-6, zu welchem Zeitpunkt pBECs zeigte spindelförmige Morphologie und wurden längs ausgerichtet erreicht wurden (C). Ratte Astrozyten im Boden ausgesät Brunnen normalerweise vermehrt konfluierende Schichten innerhalb von 5 Tagen (D-F)und wurden nach 2 Wochen des Wachstums für NCC-Modelle verwendet. Maßstab für alle Bilder: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Tight Junction Integrität des pBECs. Scheinbare Durchlässigkeit (Papp) des pBECs zu parazellulär Markierungen Saccharose (MW 342,5 14C gekennzeichnet, 14,8-25,9 GBq/Mmol) und Lucifer gelb (MW 521.57, 10 µg mL-1), aufgetragen gegen TEER. pBECs wurden auf 1,12 cm2 durchlässige Membran einfügen Filter oben Ratte Astrozyten in der Basis der Brunnen und Marker hinzugefügt, um die apikale Kammer angebaut. Nach 1 Stunde bei 37 & #730; C, war Aussehen des Markers in der basalen Kammer gemessen und apikalen, basale Papp (x 10-6 cm s-1) berechnet. TEER wurde gemessen, > 3 h bevor P-app, mit STX100C EVOM Elektroden für den leeren durchlässige Membran einfügen Filter mit Widerstand 150 Ω. durchschnittliche TEER für den gelben Luzifer Datensatz korrigiert wurde 1249 ± 80 Ω cm2 (meine ± SEM, n = 55). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Immunocytochemical Charakterisierung von pBECs. Für pBECs gewachsen auf 1,12 cm2 durchlässige Membran einfügen fügt Filter oben Ratte Astrozyten in der Basis gut, Immunfluoreszenz-Mikroskopie Analyse der engen Kreuzung Komponenten (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, und Adherens Junction Proteins (D) p120 Catenin zeigte klar definierte Lokalisierung bei Zell-Zell-Verbindungen und offenbart konfluierende Gehirn endothelial Zellschichten mit spindelförmig, nicht überlappenden Zellen. Maßstab für alle Bilder: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Reinigung und Verbreitung von pBEC

Während die Reinigungsprozedur gehören wichtige Schritte schnelle und wirksame Beseitigung der Hirnhaut und Trennung der weißen und grauen Materie, die wichtig für die Reinigung Ausbeute und Reinheit und für den richtigen Aufbau des Modells ist. Für die vorgestellten in-vitro- BBB-Modell mit pBECs haben wir verbessert und vereinfacht eine Reinigungsprozedur basierend auf mechanische Homogenisierung der isolierten graue Substanz, Größe-selektive Filterung zur Isolation von Mikrogefäßen, Verdauung mit Kollagenase , DNase und Trypsin, mit einer anfänglichen Kultur kapilläre Fragmente. Im Allgemeinen ist eine der großen Herausforderungen während der Reinigung und Pflege von Primärzellen die Beseitigung von kontaminierenden Zellen. Erfahrung mit Reinigung der primäre Gehirn endothelial Zellen hat angedeutet, dass gründliche Beseitigung von Hirnhäuten und weißen Substanz führt zu Reinheit und Ausbeute der Kapillaren verbessert, sowie erhöhte endotheliale Zellwachstum und Ausdruck von BBB Eigenschaften. Aus diesem Grund wachsen sorgfältige Entfernung der Hirnhaut (einschließlich in Furchen) im vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um Entfernung der Leptomeningeal Zellen (die Fibroblasten-ähnliche Eigenschaften haben) sowie der Arteriolen und arteriellen glatten Muskelzellen zu gewährleisten, die schneller als die endothelial Zellen in Kultur. Minimierung des weißen Substanz Materials führte ebenso reiner Endothelzellen Kulturen mit weniger kontaminierenden Zellen wachsen aus der isolierte Kapillare Fragmente. Jedoch dieses vereinfachte und schnelle Methode zur Isolierung senkt die Ausbeute an isolierten Kapillaren und Optimierung der grauen Substanz Isolation konnte die Ausbeute an jedes Gehirn erheblich verbessern. Ein Dichtegradient, die in eine alternative Reinigung Protokoll69enthalten ist, eignet sich für kostenlose endothelial Zellen zu isolieren und Endothelzellen Reinheit zu verbessern, aber es ist zeitaufwändig und kann ebenso die Ausbeute senken. Beide Reinigungsmethoden ausgiebig genutzt und charakterisiert, und teilen die Merkmale der Erzeugung von hohen TEER pBEC Modelle in MC und Astrozyten Kokulturen (normalerweise 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

Um Monolagen mit hohen parazellulär Restrictiveness zu etablieren, hat Erfahrung gezeigt, dass Perizyten von endothelialen Kulturen16beseitigt werden müssen. Porcines Gehirn Perizyten im Allgemeinen unter den pBEC Schichten wachsen und verursachen keine Löcher in den Endothelzellen Schichten wie für die Kulturen der Ratte Gehirn endothelial Zellen72,73beobachtet. Perizyten im pBEC, die Kulturen zu, jedoch tun neigen dazu, Einfluss auf die Morphologie der Endothelzellen, die breiteren erscheinen und mit unregelmäßigen Zelle Boarder16. Da Gehirn endothelial Zellen höhere Efflux-Transporter (z. B. P-Glykoprotein) als andere Zelltypen in den Mikrogefäßen auszudrücken, kann die Anzahl der kontaminierenden Zellen von Puromycin Behandlung74reduziert. Darüber hinaus verwenden Sie Plasma gewonnenen Serum (PDS) eher als Fötus oder neugeborenen Kalb Serum begünstigt das Wachstum von Endothelzellen, abgeleitet wie die PDS eine geringere Konzentration von Wachstumsfaktoren wie Wachstumsfaktor Platelet-derived und vaskulären endothelialen Wachstum hat Faktor, die gezeigt werden, zu erhöhen BBB Permeabilität und Angiogenese14,75,76,77zu stimulieren. Durch die Einführung einer ursprünglichen Kultur isolierte Kapillare Fragmente und in Kombination mit Puromycin Behandlung (4 µg/mL) und Nutzung der PDS, konnten wir die Anzahl von kontaminierenden Zellen bleiben nach der Reinigung stark reduziert, so dass danach wir könnten enge endotheliale Monolagen auf durchlässige Membran Einsätze zu etablieren. Um die beste Anlage von Endothelzellen auf Kultur Gerichte und durchlässige Membran einfügen Oberflächen zu gewährleisten, wurde beobachtet, dass eine Beschichtungsmischung aus Kollagen Typ IV (aus menschlichen Plazenta) und Fibronektin die Verbreitung erhöht Erträge und die kombinierte Mischung wurde daher bevorzugt über die traditionelle Methode mit nur Kollagen Typ I-78.

Differenzierung der Zellen und der Schaffung eines hohen TEER In-vitro- BBB-Modells

PBECs in MC behalten in der Regel viele BBB Hauptmerkmale nach Isolierung, Kokultur mit Astrozyten nicht für Induktion funktionelle enge Kreuzungen und erreichen hohe TEER Werte16,57notwendig ist. Anstrengungen zur Optimierung der Bedingungen für die Differenzierung der Endothelzellen in BBB Phänotyp beinhalten die Nutzung von Serum-haltigen Medium mit 8-CPT-cAMP, Hydrocortison7 (Erhöhung der intrazellulären cAMP Level13) ergänzt und RO 20-1724 (Beibehaltung des intrazellulären cAMP), die nach bisherigen Erkenntnissen74,79 zusammen erfolgreich verbessert die Barriere Dichtigkeit erhöht TEER und kann auch haben dazu beigetragen, mehr wiederherstellen in Vivo wie Genexpression Profil80. Jedoch kann die Verwendung von Hydrocortison für die Verschärfung der endotheliale Schicht ändern, die Reaktion der Endothelzellen auf bestimmte Reize und zum Zwecke der Nutzung des Modells für die Untersuchung von Reaktionen auf Chemo- und Zytokine während einer Entzündung, die Verwendung von Hydrocortison müssen vermieden werden.

Aus Vergleichsstudien mit MC MC mit ACM und Astrozyten Co Kulturen in beide die teilnehmenden Labore und anderswo, es wurde nachgewiesen, dass astrocytic Beitrag endotheliale BBB Funktionen verbessern und erhöhen die Barriere Dichtheit kann 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. um solch hohe Expression von BBB Phänotyp in pBECs zu erreichen, wir ein NCC mit Astrozyten und festgestellt, dass beide Schweinen und Ratten primäre Astrozyten waren vorteilhaft, wie auch in anderen Laboratorien22beobachtet. Während der Einrichtung der Astrozyten NCCs hat die Erfahrung gezeigt, dass die Reinheit und das Alter der Astrozyten Kulturen die daraus resultierende endotheliale Barriere Dichtheit, w beeinflussenITH das optimale Lebensjahr die Astrozyten wird 2 bis 8 Wochen, die korreliert mit einer beobachteten Veränderung in der Astrozyten Morphologie im Laufe der Zeit. Am Tag vor der Gründung der NCC soll eine mittlere Veränderung für die Astrozyten entfernen schädliche Stoffwechselprodukte und planen Sie genügend Zeit für die Astrozyten, Stimulation und Signalisierung Einflussfaktoren auf die Entwicklung der Barriere freizugeben. Wenn die Endothelzellen und Astrozyten Co in durchlässige Membran Insert System züchten, ist es wichtig, besonderes Augenmerk auf den Umgang mit dem Barriere-Modell. Während der mittlere Änderung müssen Aspiration und Ergänzung des Mediums und die Bewegungen der Einsätze sorgfältig erfolgen, um Störungen der endotheliale Barriere zu minimieren.

Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit

Eine große Herausforderung, wenn Primärzellen verwenden für die Festlegung von in-vitro- Modelle ist es, hohen Reproduzierbarkeit zwischen den Kulturen zu erreichen. Diese Standardisierung kann durch die Wahl der Methode, Verwendung hochwertiger Werkzeuge und Reagenzien und Erfahrung in Mikrodissektion erfüllt sein. Die hohe Reproduzierbarkeit mit niedrigen Charge zu Charge-Variante für die vorgestellte Methode ist daher die strikte Einhaltung der beschriebenen Verfahren stark abhängig.

Um eine gute Reproduzierbarkeit zwischen Chargen und Fläschchen während TEER Messungen, eine Gewebe-Widerstand-Messkammer oder epithelialen Voltmeter mit starren Miniatur Elektroden zu erreichen, anstatt flexible Stäbchen Elektroden verwendet werden können, reduzieren die Variabilität der Beobachtungswerte TEER. Neben der hohe TEER Werten (Abbildung 4), ist die Zuverlässigkeit des vorgestellten Modells, indem die entsprechenden niedrigen kleinen gelösten Durchlässigkeit (Abbildung 4) und die Immunocytochemical Charakterisierung der pBECs (Abbildung 5 bestätigt. ).

Grenzen der angewandten Methode und Modell

Die Verwendung von transgenen und Miniatur Schweine hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen, aber die Datenmenge in Vivo ist nach wie vor begrenzt, im Vergleich zu Daten für Nager-Modelle zur Verfügung, und daher kann eine Herausforderung für die in-vitro- Schweinen Daten vergleichen mit in-Vivo -Ergebnisse. Jedoch etabliert wie die Biologie des Schweins Humanbiologie stärker als viele etablierte Versuchstiere reflektiert und transgene Schweine für Modelle Studium neurologische Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit sind inzwischen84, die Verfügbarkeit von in-Vivo -Daten werden voraussichtlich mit der Zeit weniger problematisch sein.

Eine Einschränkung der aktuellen durchlässige Membran Insert Systemmodelle der BBB ist die Unfähigkeit, den Blutfluss im Mikrogefäßen zu imitieren. In Vivo, Schubspannung auf viele Aspekte der Physiologie der Endothelzellen wie Abteilung, Differenzierung, Migration und Apoptose85,86und wichtige BBB Eigenschaften wie beeinflussen nachweislich der Ausdruck der Knoten Proteine und Induktion und Polarisierung der Transporter61,85,87. Solche Bedingungen einzuführen, können die neu entwickelten mikrofluidischen Systemen88,89,90gelten.

Eine nützliche Methode, um den Effekt der ungerührte Wasserschicht (wässrige Grenzschicht) von in-vitro- Durchlässigkeit Daten zu korrigieren ist die vorhergesagte "intrinsische Durchlässigkeit" in Vivo, mit Software-basierte Ansatz21ableiten. Diese Software kann auch für detaillierte Durchlässigkeit Daten Analyse21verwendet werden.

Zukünftige Anwendungen und Anweisungen für die Methode

Da die Komponenten der neurovaskuläre Einheit gezeigt haben, dass eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung BBB Funktionen spielen und keine aktuellen in-vitro- Modell noch in der Lage wurde, vollständig zu imitieren, die in Vivo -Bedingungen, wichtige Bestandteile und Wechselwirkungen können noch fehlen. Gegenwärtige Bemühungen in der Entwicklung des vorgestellten Modells gehören die Festlegung von Triple-Kultur-Modelle mit sowohl Astrozyten und Perizyten und Experimente, die Kombination von Zellen verschiedener Arten. Einbeziehung der Perizyten wurde bisher nicht beobachtet, TEER Ebenen der Barriere deutlich steigern. Jedoch wurden Phänomen porcinen Modelle beobachtet, vergleichbar mit dreifach-Kulturen mit porcinen Endothelzellen Gehirnzellen, Ratte Astrozyten und Ratte Perizyten im Hinblick auf Barrier Dichtigkeit und Ausdruck der Markenzeichen Proteinen charakteristisch für das Gehirn sein Endothel-22. Um ein Modell zu entwickeln basierend auf menschliche Zellen, zukünftige Entwicklungen von in-vitro- BBB-Modelle für Wirkstoffforschung und Lieferung der Ableitung des menschlichen pluripotenten Stammzellen und adulte Stammzellen vertrauen darf und/oder Progenitor-21 Zellen.

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Disclosures

Die Autoren berichten keinen Interessenskonflikt.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen und Niels M. Kristiansen für technische Hilfe anerkennen, und die Lundbeck-Stiftung gewähren Anzahl R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

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References

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