Name: Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Bestimmung von Permeabilität und Diffusion in 3D-Hautmodellen mit einem Membran-Insert-System. Diese Methode ermöglicht direkte Messungen und Simulationen für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Grant Nein geschaffen. PO413/12-1 und LA 1028/7-1.

<ol><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip+developments%3A+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li>
<li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li>
<li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li>
<li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li>
<li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li>
<li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22459170">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li>
<li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Occup+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li>
<li>Ng, S. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li>
<li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Dev+Tecnol%22%5BJournal%5D)">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li>
<li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels%3A+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li>
<li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li>
<li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li>
<li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li>
<li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Rech%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li>
<li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4386065/">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).</li>
<li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li>
<li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7816761">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li>
<li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-%CE%B2-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li>
<li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11512545">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li>
<li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X86908560">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li>
<li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li>
<li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.tau.ac.il/~klafter1/258.pdf">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li>
</ol>

Uwe Marx ist der Geschäftsführer und Gesellschafter und Gerd Lindner ist Gesellschafter der TissUse GmbH, ein Unternehmen Herstellung und Kommerzialisierung der MOC-Technologie. Andere Autoren erklären keinen Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels.

Diese Studie dokumentiert eine Methode entwickelt, um die Permeation durch ein Gewebe-Konstrukt entwickelt auf einer Membran zu quantifizieren. Durchdringung von Stoffen mit unterschiedlichen molekularen Größen durch Agarosegel wurde zuerst testen und validieren der Methode und die entsprechende Simulation untersucht. Es ist bekannt, dass kleinere Moleküle schneller durch eine Matrix-Netz (mit Ausnahme der Effekt Gel Filtration von Durchlässigkeit Chromatographie) durchdringen. Ähnliche Beobachtungen wurden mit Größe-Ausschluss Experimente von Substanzen durch Sklera26, menschlichen epidermalen Membran27, menschliche Haut17und Ratte Haut28. Eine inverse Korrelation zwischen Durchlässigkeit Koeffizienten und der entsprechenden Stokes Radius (Radius einer harten Kugel, die mit der gleichen Diffusionsrate als die Moleküle beschrieben, in der Regel kleiner als der effektive Radius des Moleküls bewegt) nachweislich 26 , 28und ein ähnliches Verhältnis wurde in Experimenten mit Stoffen unterschiedlicher molekularer Größe festgestellt. Durch Auftragen der Durchlässigkeit Koeffizienten über 1/Stokes Radius, fand man eine lineare Korrelation über die vier Gruppen mit der kleinsten molekularen Größe (R2 = 0,93) (Abbildung 6). Dies bedeutet, dass simulierte Durchlässigkeit Koeffizienten mit der vorgeschlagenen Methode in eine realistische Reichweite sind.
Der Fehler von 46.15 % in den Experimenten ist etwas größer als für Durchlässigkeit Experimente mit dem Franz Diffusion Zelle System10gemeldet. Eine mögliche Erklärung könnte die Größenverteilung von Fluorescein-Herstellung-Dextran, die später erläutert wird.
Die beschriebene Methode hat wichtige Vorteile gegenüber Methoden mit dem Franz-Diffusion-Zellsystem. Erstens ist das Setup kompakter; die Experimente werden direkt in eine Membran-Insert-System ausgeführt, die das Ausmaß einer kommerziellen well-Platte (∼ 13 cm x 8,5 cm) hat. Dies ermöglicht mehrere Proben gleichzeitig ausgeführt werden, bedarf es eine separate Franz Diffusion Zelle für jede Probe. Zweitens kann die Durchlässigkeit der Hautmodell direkt in die Membran einfügen gemessen werden, wo der Anbau stattfindet. Mit Franz Diffusion Zellen müssen die Proben herausgenommen und montiert auf dem System, das ist für kleine Proben mehr umständlich und auch mehr Zeit in Anspruch.
Permeation Experimente mit Kollagen Zelle Matrizen zeigten, dass diese Methode erfolgreich in Zelle ausgesät Systeme angewendet werden kann. Das hier vorgestellte Modell wurde für Hautmodelle überprüft; Allerdings kann das Verfahren auf andere Arten von organischen Zellkulturen, z.B.Niere oder Leber angewendet werden.
In dieser Studie eine Kollagen-Zelle Modell wurde verwendet, in denen die HaCaT-Zellen vollständig die Modelloberfläche bedeckt (siehe Abbildung 5). Dies führte zu einer Verringerung der Durchlässigkeit Koeffizienten, zeigen, dass die Methode empfindlich genug ist, um die Durchlässigkeit Koeffizienten zwischen Kollagen Zellmodell mit und ohne eine Schicht von HaCaT zu unterscheiden. Im Idealfall ein Hautmodell sollte eine Barriere, die die Epidermis eine echte Haut29nähert, aufbauen und es ist daher wichtig, die Qualität (z.B. Gebäude der Dermis, Epidermis) des Modells Haut vor dem tatsächlichen Gebrauch zu überprüfen. Die Entwicklung eines Modells der Haut kann visualisiert mit Färbetechniken und von der Erkennung von Haut Eiweiß und Kollagen30,31,32quantifiziert. Die Durchlässigkeit Koeffizienten kann auch ein wichtiger Faktor für die Beurteilung der Entwicklung des Modells Haut sein, aber weitere Experimente sind erforderlich, um dies zu bestätigen. Wie bereits erwähnt ermöglicht diese Methode mehrere Proben parallel laufen. Es ist auch möglich, Proben nehmen, während der Anbau zur Messung der Durchlässigkeit und dabei beobachten die Entwicklung dieses Parameters Hautmodell.
Es sei darauf hingewiesen, dass Durchlässigkeit durch ein Gel/Kollagen-Zelle-Modell und eine Membran gleichzeitig gemessen wird. Die erkannten Durchlässigkeit Koeffizienten ist systemspezifisch, wobei die Ergebnisse der verschiedenen Hautmodelle nur verglichen werden kann, wenn Sie der gleichen Membran einfügen verwenden. Darüber hinaus muss das Hautmodell, die gesamte Anbaufläche abzudecken, um sicherzustellen, dass die Prüfsubstanz nur durch das Modell durchdringen wird und nicht neben ihr, würde die Fehler der Permeabilität gemessen zu induzieren. Ein weiterer Aspekt bei zukünftigen Experimenten berücksichtigt werden sollte ist die natürliche Umgebung der Haut. Normalerweise ist die Temperatur der Hautoberfläche niedriger im Vergleich zu den Innenbereich, der Permeation Bedingungen beeinflussen können.
Um Laborexperimente mit Hilfe von Computersimulationen auszurichten, wurde eine Methode die Parameteroptimierung für angewandte Simulation ermöglicht vorgestellt. Simulationen fanden sich gut mit den experimentellen Daten für Stoffe mit kleinen molekularen Größen übereinstimmen. Jedoch wurden Abweichungen zwischen Simulation und experimentelle Daten für Stoffe mit größeren molekularer Größen beobachtet. Großen Polysaccharid Moleküle können erhöhen die Reibung und den Diffusionsprozess in einem Gel verlangsamen. Dieser Effekt bewirkt, dass abnorme Diffusion, ist ein möglicher Grund für die Abweichung zwischen experimentellen und Simulation Werte33,34. Eine weitere Erklärung könnte die Anwesenheit von kleineren oder größeren Partikeln in Fluorescein-Herstellung-Dextran sein. Der Hersteller gibt das Molekulargewicht des Stoffes als die mittlere Größe mit einem bestimmten Bereich, wodurch kleinere und größere Partikel vorhanden sein. Es ist auch unklar, wie verteilte diese Substanzen sind, wie die kleineren Teilchen schneller durch das Gel und den fließenden Kanal durchdringen. Es ist möglich, die Simulation zu prüfen, diese Verbreitung und Reibungseffekte zu erweitern.
Die Durchlässigkeit Experiment und Simulation wurden entwickelt für den Einsatz in einem 2-oC. Mit Hilfe der Simulation kann diese experimentelle Methode direkt auf anspruchsvollere Versuchsaufbauten übertragen werden. Beispielsweise kann die Membran Insert Systemsimulation leicht auf die Geometrie des 2-OC oder zu anderen Systemen mit ähnlichen Einstellungen übertragen werden. Diese Option der Modulierung der Simulations kann verwendet werden, um die Gestaltung der zukünftigen Experimente zu unterstützen. Darüber hinaus können Nebenwirkungen wie Verdunstung, abnorme Diffusion und Membran-Effekte integriert werden, um die Simulation, und verbessert die Genauigkeit zu erhöhen. Das Simulationsprogramm gibt die Möglichkeit, ändern oder ergänzen die Simulation Gleichung, sowie anderen physikalischen Modulen zu integrieren, um andere Aspekte der Haut Modellentwicklung zu untersuchen. Ein Beispiel ist die Simulation von Glukose-Verbrauch und Laktat-Produktion in einem Kollagen-Zelle-Modell.
Ein besonders interessanter Aspekt bei der Prüfung von medizinischen Substanzen ist wie die Stoffe in einem Organ-on-a-Chip-System verteilt werden. Die Simulation und Durchlässigkeit Parameter, die meine Hilfe beantworten Fragen wie z.B. wie schnell eine Substanz in das System durchdringt sowie die Konzentration für andere Gewebe in einem multi-organ-Chip zur Verfügung stehen. Diese Methode kann zu unterstützen und verbessern, die Entwicklung und Erprobung solcher Orgel-on-Chip-Systeme.

Organo-typische 3D Kulturen sind leistungsfähige Werkzeuge für Medikamentenentwicklung und Substanz Test1geworden. In dieser Hinsicht sind menschliche Hautmodelle von besonderem Interesse aufgrund gesetzlicher Vorschriften, wie Sie in der Kosmetikindustrie. Sie führten später zur Entwicklung von zahlreichen 3D Hautmodelle für den Einsatz entweder auf eigenen als Einzel-Orgel-Kultur im Multi-well-Platten oder multi-organ-Chips in Kombination mit zusätzlichen Orgel Modelle, z.B., die Leber2.
In Bezug auf Anbau eines Haut-Äquivalent ist die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) ein wesentliches Element für richtige epidermalen Differenzierung3. Zelle Kultur Einsätze bestehend aus einem Gefäß mit einer Flüssigkeit-durchlässige Membran an der Unterseite dienen in der Regel ein ALI zu etablieren. ALIs sind weit verbreitet in handelsüblichen Hautmodelle z. B. EpiDerm4und Phenion5Episkin6, für die Kultur der Hautmodelle mit Größen von 96-Well (4,26 mm im Durchmesser) bis zu 12-Well (12,2 mm im Durchmesser) Platten genutzt. Die hier beschriebene Methode bestimmt die Durchdringung von Stoffen in einem Membran-Insert-System.
Die Durchlässigkeit Koeffizienten ist ein wichtige Parameter zur Beurteilung der Qualität von jedem kultivierten Haut-Modell im Vergleich zu nativen Haut5und wird verwendet, um zu beurteilen, wie schnell Wirkstoffe durch die Haut wandern. Vor allem, wenn Drogen oder Kosmetik Produkte auf die Haut aufgetragen werden müssen, ist dieser Parameter wichtig zu verstehen, wenn genau die Wirkstoffe passieren. Eine Simulation kann weiter helfen, um das Verhalten des Systems und anschließend die erforderliche zeitaufwändige experimentelle Anstrengungen zu reduzieren, vor allem, wenn eine große Anzahl von Substanzen beteiligt ist.
Die Franz-Diffusion-Zelle ist State-of-the-Art für Permeation mit Haut experimentiert und Haut-5,6,7,8,9 Modelle. Dieses Gerät besteht aus zwei Kammern mit einer festen Probe (Diffusionssperre) dazwischen. Die zu testende Substanz wird direkt an die Spitze der Stichprobe (Spender Fach) angewendet und die Konzentration der permeierenden Verbindung detektiert werden, auf der gegenüberliegenden (Akzeptor) Fach. Auf der Seite Akzeptor sind konstante Temperatur und Konzentration homogene Substanz durch eine Temperatur-Kammer und ein Magnetrührer sichergestellt. Proben können auf der Akzeptor-Seite der Franz-Zelle eine Probenahme Arm entnommen. Dieses System ist mit einem Höhenbereich zwischen 19 cm und 179 cm relativ große10,11. Eine weitere Methode zur Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in Gel-artige Substanzen und Geweben ist FRAP. Diese Technik nutzt das Prinzip der bleichen Eindringmittel gekennzeichnet Partikel in das Gel und dann bestimmen die Regenerationszeit des gebleichten Bereich zur Berechnung der Diffusion Koeffizient12,13,14.
Darüber hinaus (FTIR) Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie lässt sich Partikelbewegung mit Infrarot-Licht Absorption zu erkennen um die Permeation von Stoffen in Haut15,16bestimmen. Jedoch müssen diese oder andere bildgebenden Verfahren (z.B. zwei-Photonen-Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie17) intensive Instrumente Kosten.
In diesem Artikel wird eine Methode direkt messen vorgestellt die Durchlässigkeit einer Barriere innerhalb einer Membrananlage einfügen wo ein Hautmodell angebaut werden. Diese Methode ermöglicht Durchlässigkeit Experimente mit einer großen Anzahl von kleinen Proben (gut bis 4,26 mm Größe) in einem kompakten System ausgeführt werden. Dies steht im Gegensatz zu Franz Diffusion Zelle, wo ein separates Gerät braucht man für jede Sonde, die auf dem Gerät montiert werden und ist schwer, für kleine Proben (4,26 mm Größe) zu realisieren. Da die Methode keine Großgeräte (z.B. ein multiphoton oder confocal Mikroskop) erforderlich ist, ist darüber hinaus eine Reduzierung Zeit-und Kosteneinsparungen erzielt.
Alles, was die Experimente, in mikroporösen Membran durchgeführt wurden einfügen Systeme mit einer Probe (Barriere) bestehend aus Agarosegel oder eine Kollagen-Zellmodell gegründet auf der Membran. Fluoreszierende Stoffe (Spender) mit unterschiedlichen molekularen Größen wurden an die Spitze der Stichprobe angewendet und die Konzentration des Stoffes durchdrungen auf der Unterseite (Akzeptor) mit einem Fluoreszenz-Platte-Kartenleser erkannt wurde (siehe Abbildung 1). Um die Methode zu validieren und testen die Genauigkeit der Simulation, wurden Agarose-Gele produziert und verwendet als Barriere. Hydrogele sind in der Regel für die Untersuchung der Diffusion und Permeation Prozesse in porösen Medium in den biologischen Wissenschaften13verwendet. Die Methode wurde dann in eine Zelle ausgesät System bestehend aus einem Kollagen-Matrix primäre Fibroblasten und menschlichen Erwachsenen niedrige Kalzium hohe Temperatur Keratinozyten (HaCaT) Zellen (Zelle-Matrix-Modell), die eine vereinfachte Haut Modell18,19 ist getestet .
Darüber hinaus wurde die Permeation Prozess mittels Strömungssimulationen mit computational Fluid Dynamics – simuliert. Es wurde festgestellt, dass die Diffusionskoeffizienten mittels Parameteroptimierung, konnte aus den experimentellen Daten berechnet werden. Diese Simulation bietet in der Regel verschiedene Anwendungen; zum Beispiel ist es möglich, vorherzusagen, eine Permeation beruhend auf kurze Experimente und die Simulation kann erheblich reduzieren die Anzahl der Experimente.
Experimentelle Methode und Simulation wurden entwickelt für die Anwendung auf eine Orgel-on-a-Chip-System1,20,21, kommerziell entwickelt, speziell der 2-Orgel-Chip (2-OC)1,22, 23,24,25. Im Prinzip kann der Permeation Prozess von jedem Organ-Modell basierend auf Membran-Insert-Systeme auf diese Weise beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>Hochauflösendes Pulver</td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Kollagen R Lösung 0,4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>Hohe Glukose mit L-Glutamin</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fötales Kälberserum</td></tr><tr><td>Fluorescein Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>kein Calcium, kein Magnesium, mit Phenolrot</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granuliert</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>Tabletten</td></tr><tr><td>Transwell Zellkultureinsätze</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 Well, 0,4 & Mikro; Mio. Porengröße</td></tr><tr><td>Transwell Zellkultureinsätze</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 Well, 0,4 & Mikro; m Porengröße</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>mit EDTA</td></tr></tbody></table>

eine methode zur bestimmung und simulation von durchlässigkeit und diffusion in einem 3d gewebe-modell in einer membran einfügen system für multi-well-platten

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In Vitro kultiviert Hautmodelle für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen zunehmend relevant geworden und auch in der Medikamentenentwicklung sowie Substanz Tests eingesetzt. Diese Modelle werden meist in Membran-Insert-Systeme, deren Durchlässigkeit gegenüber verschiedenen Substanzen wird ein wesentlicher Faktor kultiviert. Angewandte Methoden zur Bestimmung dieser Parameter erfordern in der Regel in der Regel große Stichproben (z.B. Franz Diffusion Zelle) oder aufwändige Ausrüstung (z.B. Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP)). Diese Studie stellt eine Methode zur Bestimmung der Durchlässigkeit Koeffizienten direkt in Membran-Insert-Systeme mit Durchmessern von 4,26 und 12,2 mm (Anbaufläche). Die Methode wurde mit Agarose und Kollagen Gele sowie ein Kollagen Zellmodell Vertretung Hautmodelle validiert. Die Permeation Prozesse von Stoffen mit verschiedenen molekularen Größen und Permeation durch verschiedene Handy-Modelle (bestehend aus Kollagen Gel, Fibroblasten und HaCaT) wurden genau beschrieben.
Um die oben genannten experimentellen Methode zu unterstützen, wurde darüber hinaus eine Simulation gegründet. Die Simulation passt die experimentellen Daten gut für Stoffe mit kleinen Molekülgröße, bis zu 14 x 10-10 m Stokes Radius (4.000 MW), und ist somit ein viel versprechendes Instrument, um das System zu beschreiben. Darüber hinaus ist die Simulation experimentelle Anstrengungen erheblich reduzieren kann und robust genug ist, erweitert oder komplexere Setups angepasst werden.

Durchlässigkeit Experimente in einer 96-Well-Membran einfügen-System mit 2 % Agarosegel wie eine Barriere wurden durchgeführt, um die Genauigkeit der Simulation zu bewerten. Fluorescein Natrium-Salz (NaFl) und Fluorescein erfolgt-Dextranes (FD) wurden verwendet, um die Auswirkungen der molekularen Größe der diffundierende Substanz von 5 x 10-10 m bis 45 x 10-10 m Stokes Radius (376.27-40.000 Mol Wt) zu überprüfen. Die Simulation native Parameteroptimierung wurde verwendet, um die Simulation zu experimentellen Daten passen.
Zu diesem Zweck wurden die Pisten nur lineare Teile der simulierten Durchlässigkeit zu den experimentellen Ergebnissen verglichen. Für molekulare Untergrößen waren Simulation und experimentelle Daten in guter Übereinstimmung mit 99,2 % NaFl und 80,2 % für FD 4.000 (siehe Abbildung 4a und 4 b Abbildung). Größere Molekülgröße erzeugt höhere Abweichungen zeigen Zusammenhänge von 50,5 % für FD 10.000, 79,7 % für FD 20.000 und 53,6 % FD 40.000. Kurvenverlauf in den Simulationen zeigten eine Verzögerung zu Beginn und einen stärkeren Anstieg im weiteren Verlauf des Graphen (siehe Abbildung 4 c–4e).
Durchlässigkeit Koeffizienten und simulierten Diffusionskoeffizienten ergeben sich Tabelle 4. Die Permeation Koeffizienten verringert sich mit zunehmender Molekülgröße. Standardabweichung lag zwischen 0,08 x 10-8 m/s und 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), die auf einen absoluten Fehler von 4.18 bis 46.15 % entsprach. Versuche mit größeren Molekülen zeigten einen größere absoluten Fehler. Die simulierten Diffusionskoeffizienten verhielt sich sehr ähnlich an experimentellen Durchlässigkeit Koeffizienten. Stoffe mit größeren Radien Stokes zeigte abnehmende Diffusionskoeffizienten und des absoluten Fehlers reichte 9,09 bis 18.46 % (N = 3).
In zusätzlichen Permeation Experimente dienten vier verschiedene Kollagen Modell Zelltypen als Barrieren in einer 12-Well-Membran System einfügen. Diese Modelle umfassen eine zellfreie und eine Zellenmodell mit verschiedenen Kombinationen der primäre Fibroblasten in der Kollagen-Gel und HaCaT auf der Oberfläche. Die folgenden Kombinationen wurden verwendet: Kollagen (Kol.) als zellfreie Modell, Kollagen + Fibroblasten (Kol. + F.), HaCaT (Kol. + H.), und Kollagen + Fibroblasten, Kollagen + HaCaT (Kol. + F. + H.). Fluorescein Natrium-Salz mit DMEM + 10 % FCS diente als Spender Substanz. Für Bild war Analyse der das Kollagen Zellenmodell, Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (HE) verwendet. Diese Färbung erfolgte mit der Hersteller-Protokoll. In Abbildung 5ist solch ein Fleck mit einem repräsentativen Kol. + F. + H.-Modell dargestellt. Das HE Flecken leicht die Gewebestruktur des Kollagen-Matrix. Die Fibroblasten befinden sich in der Matrix und die Kernen der Fibroblasten und HaCaT-Zellen sind in dunklem Violett gefärbt. Am Anfang der Kollagen-Matrix gibt es eine Ebene mit vielen Kernen, die die Kerne von HaCaTs, Aufbau einer einschließenden Schicht auf der Oberseite des Modells sein sollte.
In Tabelle 5werden experimentelle Permeation Koeffizienten und simulierten Diffusionskoeffizienten aufgelistet. Ein Trend ist für die meisten Modelle mit HaCaT, die geringere Durchdringung/Diffusionskoeffizienten im Vergleich zu den Modellen ohne HaCaT ersichtlich. Der absolute Fehler der Permeation Koeffizienten ist 10,9-24,4 %, und für die Verbreitung Koeffizienten 5.2-12,9 %.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Abbildung 1: Seitenansicht des Experiments in einer Membran Durchlässigkeit insert System. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Abbildung 2: beispielhafte Grafik eines Experiments Durchlässigkeit. Die Konzentration von den Akzeptor ist im Laufe der Zeit aufgetragen. Zwei gestrichelte Linien Klammer den nahezu linearen Teil des Diagramms. Die Steigung der linearen Teil dient zur Bestimmung der Durchlässigkeit Koeffizienten. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Abbildung 3: Einfügen von Geometrie und Maschen der Membran in der Simulation System. (ein) Geometrie der 96-Well-Membran System einfügen. (b) Geometrie der 12-Well Membran Insert System. (c) Netz der 96-Well-Membran-Insert-System. (d) Netz der Membran 12-Well-Insert-System. (e) Querschnitt und Parameter der Membran System einfügen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Abbildung 4: Vergleich der experimentellen Daten aus einem Permeation Experiment bis hin zur optimierten Simulation. (ein) Fluorescein Natrium-Salz, (b) Fluorescein erfolgt-Dextran 4.000 Mol WT (c) 10.000 Mol Gew.%, (d) 20.000 Mol WT und (e) 40.000 Mol WT <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Abbildung 5: Vertreter HE Färbung eines Kollagen-Zelle-Modells (Fibroblasten, Kollagen + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Abbildung 6: Durchlässigkeit Koeffizienten in Abhängigkeit von der 1/Stokes-Radius mit Fluorescein Natriumsalz und Fluorescein erfolgt-Dextran in einer 96-Well-Membran einfügen System. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Experession für 96 Brunnenanlage in mm</td>
			<td>Experssion für 12-Well-System in mm</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5,65 [mm]</td>
			<td>14.7 [mm]</td>
			<td>Durchmesser des Brunnens</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_A</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Durchmesser der Membran</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8,79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>Durchmesser von den Akzeptor</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Höhe der Barriere</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Abstand zwischen gut und unten</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Hoch von den Akzeptor</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>H_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Eintauchtiefe</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Umkreis von Immersion Ball+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>R + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>Z-Position des Balles Immersion+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Geometrie-Parameter für "Chemischer Spezies Transport" Simulation. + Nur zur Verwendung für die Simulation von Agarose Gel in 96 gut Membran System einfügen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Ausdruck</td>
			<td>Wert</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/Mol]</td>
			<td>0.26576 Mol/m2
</td>
			<td>Konzentration von Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/Mol]</td>
			<td>0,5 Mol/m2</td>
			<td>Konzentration von FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/Mol]</td>
			<td>0,2 Mol/m2</td>
			<td>Konzentration von FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/Mol]</td>
			<td>0,1 Mol/m2</td>
			<td>Konzentration von FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/Mol]</td>
			<td>0,05 Mol/m2</td>
			<td>Konzentration von FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1E-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1E - 9m2/s</td>
			<td>Diffusionskoeffizienten von Anmachwasser</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Physikalische Parameter für die Simulation "Chemischer Spezies Transport".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Ausdruck</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Definition der Akzeptor-Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Änderung der Faktor für D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Parameter für die Simulation der "Optimierung".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Durchdringen</td>
			<td>Durchlässigkeit Koeffizienten (m/s) x 10-8</td>
			<td>Diffusionskoeffizienten (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Stokes Radius des Permeats (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4,79 ± 0,20</td>
			<td>1.94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4.000</td>
			<td>2,37 ± 0,31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0,22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20.000</td>
			<td>0.65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40.000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Durchlässigkeit und Diffusion Koeffizient von Stoffen mit anderen Stokes Radius durch 2 % Agarose-Gel + Membran in einer 96-Well-Membran einfügen System. (Fluorescein Natriumsalz = FL. So., Fitc-Dextran = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modell</td>
			<td>Durchlässigkeit Koeffizienten (m/s) x 10-8</td>
			<td>Diffusionskoeffizienten (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kol.</td>
			<td>2.18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kol. + F.</td>
			<td>1,77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kol. + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kol. + F. + H.</td>
			<td>1.65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: Durchlässigkeit und Diffusion Koeffizient von Fluorescein Natriumsalz durch eine Kollagen-Zelle-Modell in einem 12-gut Membran einfügen System (Kol = Kollagen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).

Eine Methode zur Bestimmung der Durchlässigkeit in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten und in Silico Parameteroptimierung für die Berechnung des Diffusionskoeffizienten mittels Simulation werden vorgestellt.

Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Permeabilität und die Diffusionskoeffizienten von 3D-Hautmodellen in einem kleinen Membraneinsatzsystem zu bestimmen. Diese Fragen können dazu beitragen, zentrale Fragen zum 3D-Hautgewebe-Engineering für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen zu beantworten, bei denen die Permeabilität und der Diffusionskoeffizient wesentliche Qualitätsfaktoren sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Messung dieses Koeffizienten innerhalb eines kleinen Multi-Well-Einsatzes ermöglicht.Das kleine Membraneinsatzsystem in der Simulation kann für den Einsatz in Organen auf dem Schiff und anderen Anwendungen, die Membraneinsatzsysteme verwenden, weiter modifiziert werden. Um ein Agarose-Gel herzustellen, tragen Sie zunächst 28,6 Mikroliter frisch zubereitetes flüssiges Agarose-Gel mit einer Temperatur von 80 Grad Celsius auf jede Membran eines 96-Well-Membran-Inset-Systems auf. Nach 10 Minuten ist das Gel erstarrt und kann für einen Permeabilitätstest verwendet werden.Um ein Kollagenzellmodell herzustellen, mischen Sie zunächst 125 Mikroliter HBSS und einen Milliliter Kollagen-R-Lösung auf Eis, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Als nächstes fügen Sie der Mischung 125 Mikroliter primärer Fibroblasten hinzu, die in vollständigem Medium suspendiert sind. Und fügen Sie 28,6 Mikroliter der resultierenden Zelllösung in jede Vertiefung eines neuen 96-Well-Membraneinsatzsystems hinzu.Geben Sie nach 30 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator 75 Mikroliter vollständiges Medium auf die Oberfläche des Gels und 300 Mikroliter vollständiges Medium auf den Boden jeder Vertiefung für eine Inkubation über Nacht im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 75 Mikroliter humane adulte Keratinozyten mit niedrigem Kalziumgehalt und hoher Temperatur in jedem Kollagenzellmodell und stellen Sie die Platte für weitere drei Tage in den Zellkultur-Inkubator. Am vierten Tag aspirieren Sie das Medium von der Oberfläche des Zellmodells und stellen Sie die Platte für weitere sieben Tage in den Inkubator zurück.Um einen Permeabilitätstest durchzuführen, geben Sie 75 Mikroliter Spendersubstanz in ein kleines Well-Insert-Modellsystem von Interesse und geben Sie 300 Mikroliter Akzeptorsubstanz in den Boden jeder Vertiefung. Stellen Sie die Platte fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 Prozent Luftfeuchtigkeit und ca. 480 U/min auf einen Shaker, übertragen Sie das Membraneinsatzsystem einmal pro Stunde in eine leere 96-Well-Platte und messen Sie die diffuse Fluoreszenz in den unteren Wells der Experimentierplatte auf einem Plattenlesegerät. Öffnen Sie am Ende des Permeabilitätsexperiments die entsprechende Modellierungssoftware und starten Sie ein neues Modell.Wählen Sie Modell-Assistent und 3D-Modell aus. Fügen Sie Transport verdünnter Spezies hinzu, und klicken Sie auf Studie. Wählen Sie dann Zeitabhängig und klicken Sie auf Fertig.Klicken Sie unter Globale Definitionen mit der rechten Maustaste, um Parameter hinzuzufügen, und geben Sie die geometrischen und physikalischen Parameter in das Raster ein. Richten Sie die Geometrie des Membraneinfügesystems aus den Experimenten ein, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Definitionen, um zwei Domänensonden hinzuzufügen, wobei Sie eine Sonde als Akzeptordomäne und die andere als Donordomäne auswählen. Legen Sie beide Domänen auf den Durchschnitt mit einem Ausdruck C und einer Einheit von Mol pro kubiertem Meter fest.Und stellen Sie den Diffusionskoeffizienten unter Transporteigenschaften eins und Transport von verdünnten Spezies ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport verdünnter Spezies, um eine zweite Transporteigenschaft mit zwei hinzuzufügen, und wählen Sie die zweite Barriere in der Domänenauswahl aus. Beim Transport verdünnter Spezies ist für den Anfangswert eins die Konzentration als Null zu definieren.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport verdünnter Spezies, um einen zweiten Anfangswert zwei hinzuzufügen, und wählen Sie den Donor als dritte Domäne aus. Stellen Sie die Konzentration als Anfangskonzentration der fluoreszierenden Donorsubstanz ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport der verdünnten Spezies, um eine Symmetrie hinzuzufügen, und wählen Sie alle Flächen der Berandungsauswahl aus, die die gesamte Geometrie widerspiegeln.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netz, um zwei freie Tetraeder hinzuzufügen und die zweite Barriere als Domäne festzulegen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den freien Tetraeder, um die Größe des vordefinierten Netzes zu extrafein hinzuzufügen. Im zweiten freien Tetraeder setzen Sie den Akzeptor und den Donor als Domänen und das vordefinierte Netz auf feiner.Klicken Sie dann unter Studie eins auf Berechnen, um die Simulation zu starten. Um den Diffusionskoeffizienten an die von der Diffusionssimulation generierten Daten anzupassen, öffnen Sie das Menü "Hellseher hinzufügen" und wählen Sie "Mathematik". Lokalisieren Sie Optimierung und Empfindlichkeit.Wählen Sie Optimierung aus und klicken Sie auf Zur Komponente hinzufügen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf Definitionen, um Variablen hinzuzufügen, und geben Sie die Variablen aus Tabelle drei manuell ein. Klicken Sie anschließend im Menü der Komponentenkopplung mit der rechten Maustaste auf Definitionen, fügen Sie durchschnittlich eins hinzu, gefolgt von der manuellen Hinzufügung des Akzeptors als Operatorname, und wählen Sie Domäne eins aus.Exportieren Sie die experimentellen Daten in ein neues Textdokument. Verwenden Sie ein Semikolon, um die Daten in Spalten zu unterteilen, und einen Zeilenumbruch, um die Daten in Zeilen zu unterteilen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Optimierung, um das globale Ziel der kleinsten Quadrate hinzuzufügen, und hängen Sie das Textdokument an die experimentellen Daten an.Klicken Sie auf globales Ziel der kleinsten Quadrate, um die erste Spalte als Zeitspalte und die zweite Spalte als Wertspalte eins zu definieren. Geben Sie in der Spalte Ausdruck des Werts die Variable C ein.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Optimierung, um die globale Steuervariable eins hinzuzufügen. Und deklarieren Sie die D-Unterstrichsuche als Variable mit einem Anfangswert von eins, einer Untergrenze von Null und einer Obergrenze von 1.000.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Studie eins, um eine Optimierung hinzuzufügen. Und wählen Sie SNOPT als Optimierungslösermethode aus. Legen Sie die Optimalitätstoleranz auf eins hoch minus acht fest.Stellen Sie dann den Diffusionskoeffizienten für die Barriere auf D ein.Stellen Sie die Simulationszeit in der Untersuchungseinstellung von null Sekunden auf 22.000 Sekunden mit einem Intervall von 100 Sekunden ein, und klicken Sie auf Berechnen, um mit der Parameteroptimierung zu beginnen. Die histologische Analyse eines Kollagenzellmodells zeigt eine leichte Färbung der Fibroblasten innerhalb der zentralen Matrix. An der Spitze der Kollagenmatrix ist eine Schicht zu beobachten, die viele Kerne enthält, die wahrscheinlich aus menschlichen erwachsenen Keratinozyten mit niedrigem Kalziumgehalt und hoher Temperatur bestehen.Unter Verwendung von Fluorescein-Natriumsalz und Fluorescein-Isothyocyanat-Dextran wird der Einfluss der Molekülgröße der diffundierenden Substanz überprüft, was zeigt, dass bei kleinen Molekülgrößen die Simulation und die experimentellen Daten für beide Moleküle gut übereinstimmen. Größere Molekülgrößen erzeugen jedoch in Simulationen höhere Abweichungen in den Kurvenverläufen, was eine Verzögerung zu Beginn und einen stärkeren Anstieg im späteren Verlauf der Graphen zeigt. Tatsächlich nimmt der Permeationskoeffizient mit zunehmender Molekülgröße ab, wobei sich die simulierten Koeffizienten ähnlich wie die experimentellen Permeabilitätskoeffizienten verhalten.Bemerkenswert ist, dass die meisten Modelle, die humane adulte kalziumarme Hochtemperatur-Keratinozyten verwenden, niedrigere Permeations- und Diffusionskoeffizienten aufweisen als Modelle ohne menschliche adulte adulte kalziumarme Hochtemperatur-Keratinozyten. Das Kollagen-Sim-Modell kann in 11 bis 12 Tagen erstellt werden, und die Permeationsmessung kann in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, die Randbedingungen wie die Temperatur, das Füllvolumen, die Konzentration der aufgetragenen Substanz, die Luftfeuchtigkeit und den Membranprozess konstant zu halten, um die Variation des Permeationskoeffizienten zu reduzieren.Mit Hilfe dieser Modulsimulation kann der experimentelle Aufwand reduziert und die Langzeitleistung vorhergesagt werden. Es kann auch an andere Permeationsgeräte oder Organbesitzsysteme angepasst werden. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der pharmazeutischen und kosmetischen Anwendungen sowie der Interaktionsentwicklung im Tissue Engineering den Weg, um die Diffusionspermeationsprozesse in künstlichen Geweben zu erforschen.

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

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Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Wir stellen ein Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Gefäßkanälen mit flexiblen Größen und gewünschten Mustern auf einer Standard-Sechs-Well-Platte unter Verwendung der 3D-Bioprinting-Technologie vor, die als Gefäße auf einer Platte (VOP) bezeichnet wird. Diese Plattform hat das Potenzial, die Entwicklung von Therapeutika für die mit einem kompromittierten Endothel verbundenen Erkrankungen voranzutreiben.

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Erfahren Sie die Bestimmung von Permeabilität und Diffusion in 3D-Hautmodellen mit einem Membran-Insert-System. Diese Methode ermöglicht direkte Messungen und Simulationen für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen.

Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten (Video) | JoVE Journal

Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten

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