Uitgebreid autopsie programma voor individuen met multiple sclerose

* These authors contributed equally
Neuroscience
 

Summary

Multiple sclerose is een inflammatoire demyelinerende ziekte zonder genezing. Analyse van hersenweefsel biedt belangrijke aanwijzingen om de pathogenese van de ziekte te begrijpen. Hier bespreken we de methodologie en downstreamanalyse van MS hersenweefsel verzameld via een uniek snel autopsie programma in werking in de Cleveland Clinic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, K., Ontaneda, D., Chen, J., Volsko, C., Dudman, J., Christie, E., Dunham, J., Fox, R. J., Trapp, B. D. Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (149), e59511, doi:10.3791/59511 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

We beschrijven een Rapid tissue donatieprogramma voor individuen met multiple sclerose (MS) dat vereist dat wetenschappers en technici op afroep 24/7, 365 dagen per jaar zijn. Deelnemers geven toestemming om hun hersenen en ruggenmerg te doneren. De meeste patiënten werden gevolgd door neurologen in het Cleveland Clinic Mellen Center voor MS behandeling en onderzoek. Hun klinische cursussen en neurologische handicaps zijn goed gekarakteriseerd. Kort na de dood wordt het lichaam getransporteerd naar het MS Imaging Center, waar de hersenen in situ worden gescand door 3 T magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Het lichaam wordt vervolgens overgebracht naar de autopsie kamer, waar de hersenen en het ruggenmerg worden verwijderd. De hersenen zijn verdeeld in twee hersenhelften. Een halve bol wordt onmiddellijk in een snijden box geplaatst en alternatieve 1 cm dikke plakjes worden ofwel in 4% Paraformaldehyde vastgesteld voor twee dagen of snel bevroren in droogijs en 2-methylbutaan. De korte-vaste hersen segmenten worden opgeslagen in een cryopreservatie-oplossing en gebruikt voor histologische analyses en immunocytochemische detectie van gevoelige antigenen. Bevroren plakjes worden opgeslagen bij-80 °C en gebruikt voor moleculaire, immunocytochemische en in situ hybridisatie/RNA Scope studies. Het andere halfrond wordt gedurende enkele maanden in 4% Paraformaldehyde geplaatst, in de snijden box geplaatst, opnieuw gescand in de 3 T magnetische resonantie (Mr) scanner en gesneden in centimeter dikke plakjes. Postmortem in situ Dhr images (Mri's) zijn samen geregistreerd met 1 cm dikke hersen schijfjes om de correlaties van MRI-pathologie te vergemakkelijken. Alle hersen schijfjes worden gefotografeerd en hersenletsels worden geïdentificeerd. Het ruggenmerg wordt in 2 cm segmenten gesneden. Alternatieve segmenten worden vastgesteld in 4% Paraformaldehyde of snel bevroren. De snelle aanschaf van postmortem MS-weefsels maakt pathologische en moleculaire analyses mogelijk van MS-hersenen en ruggengraat koorden en pathologische correlaties van MRI-afwijkingen in de hersenen. De kwaliteit van deze snel verwerkte postmortemweefsels (meestal binnen 6 h van de dood) is van grote waarde voor MS-onderzoek en heeft geresulteerd in veel high-impact ontdekkingen.

Introduction

Een van de beste manieren om een ziekte te bestuderen is om het zieke weefsel zelf te onderzoeken. Dit presenteert uitdagingen voor diegenen die ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) bestuderen. Biopsies van zieke hersenen en ruggenmerg zijn zeer zeldzaam en meestal betrekking hebben op atypische gevallen. Autopsie tarieven voor individuen met CNS ziekten zijn drastisch gedaald in de afgelopen jaren, en wanneer uitgevoerd, ze bieden vaak geen snelle aanschaf van weefsels. Deze uitdagingen hebben geresulteerd in de oprichting van ziekte gerichte hersen banken, waaronder verschillende gericht op het verzamelen van weefsels van individuen met multiple sclerose (MS). MS is een ontstekings-gemedieerde ziekte van het CZS die myeline, oligodendrocyten (myeline vormende cellen), neuronen en axonen vernietigt. De meerderheid van de MS-patiënten heeft een bi-fasische ziekte cursus die begint met aanvallen van neurologische handicaps met variabel herstel dat zich uiteindelijk ontwikkelt tot een geleidelijk progressieve ziekte die waarschijnlijk neurodegeneratief is in de natuur1. Voor de meerderheid van de gedoneerde MS-hersenen zijn de postmortemintervallen (PMI) tussen de dood en weefsel verwerking meer dan 24 uur. Hoewel deze weefsels waardevolle informatie hebben verschaft over pathologische veranderingen in MS-hersenen, zijn ze niet geschikt voor geavanceerdere moleculaire studies die krachtige inzichten kunnen geven in pathofysiologie van de ziekte. Dit is met name het geval voor genprofilerings studies, die intact RNA vereisen.

Om de hierboven besproken beperkingen te overwinnen, hebben we een Rapid tissue donatieprogramma ontwikkeld dat MRI/pathologische correlaties mogelijk maakt. Dit protocol biedt goed bewaarde weefsels die geschikt zijn voor moderne moleculaire studies en maakt directe vergelijking van hersen pathologie en MRI-afwijkingen in MS-hersenen mogelijk. Het Cleveland Clinic programma voor weefseldonatie met multiple sclerose bestaat al meer dan 20 jaar. Dit snelle weefseldonatie programma koopt hersenen en ruggengraat koorden van individuen met MS en andere geassocieerde auto-immune neurologische aandoeningen. Het programma is bedoeld om in situ MRIs binnen 6 h van de dood te verkrijgen, gevolgd door verwijdering van de hersenen en het ruggenmerg voor weefsel verwerking.

Werving
Donaties worden verkregen door middel van een ante-mortemtoestemming die rechtstreeks is verkregen van patiënten (vooraf ingestemd) of van de naaste van de kin na de dood. Vooraf toegestemd patiënten worden meestal geïdentificeerd uit de klinische populatie in het Mellen Center voor multiple sclerose behandeling en onderzoek in Cleveland, Ohio. Hoewel de voorkeur in rekrutering in het Rapid tissue donatieprogramma wordt gegeven aan patiënten die in longitudinale onderzoeken zijn gevolgd, is het open voor alle patiënten die in het centrum worden gezien. Deelnemers die zich vóór de dood inschrijven, krijgen instructies voor familieleden of zorgverleners om contact op te nemen met het onderzoeksteam, hetzij op het moment van overlijden of wanneer de dood dreigt te worden verwacht. De tweede methode voor individuen om het weefseldonatie programma in te voeren is op het moment van overlijden door toestemming door de naaste van kin. De staat Ohio eist dat sterfgevallen worden doorverwezen naar een federaal-gemandateerde orgaan Procurement organisatie LifeBanc, die in 20 provincies in het noordoosten van Ohio opereert. LifeBanc screent alle sterfgevallen voor een diagnose van MS, wat een uitsluiting is voor orgaandonatie. LifeBanc heeft een regeling getroffen om onderzoekers van het MS tissue donatieprogramma op de hoogte te stellen van alle sterfgevallen met een geassocieerde diagnose van MS die zich voordoen binnen een straal van 75 mijl van de Cleveland Clinic. Naast kin en ziekenhuispersoneel worden vervolgens gecontacteerd door het weefseldonatie programma personeel en toestemming wordt verkregen voor donatie van hersenen en ruggenmerg weefsels. Deze twee methoden voor de aanwerving van een ante-en een post-mortem via LifeBanc resulteren in ongeveer 10-12 hersen donaties per jaar. Aanpassingen worden aangebracht in de leeftijdsgrens van de dood voor het beheren van het aantal verwijzingen die zijn afgeleid van LifeBanc.

Aanschaf van donaties
Het programma vereist 24 h dekking, 365 dagen per jaar door leden van het weefseldonatie programma voor weefsel inkoop. Een gecentraliseerde kennisgeving van weefseldonatie e-mail/pager/mobiel apparaat tekst meldingssysteem wordt gebruikt door het klinische team dat weefsel donaties. LifeBanc is voorzien van nummers om contact op te nemen met personeel voor het weefseldonatie programma. Leden worden op de hoogte gesteld van overlijden door ziekenhuis aanbieders/Next of kin (vooraf ingestemd) of door LifeBanc en andere verwijzingsbronnen. Ten eerste wordt een bepaling van de tijd van overlijden en haalbaarheid van weefseldonatie gemaakt. Sterfgevallen worden vervolgens gescreend op aandoeningen die mogelijk resulteren in weefsel van slechte kwaliteit, met inbegrip van langdurige pre-mortem hypoxie, enorm destructief hersenweefsel (bijv. grote intracraniële bloeding, uitgebreide bi-hemiferische beroertes, extensieve tumor Last), verlengde ventilator ondersteuning (> 3 dagen) en langdurig gebruik van vasoactieve agentia (> 3 dagen) vóór de dood. Wanneer een medische examinator betrokken is bij een overlijden, kan de studie-neuroloog met de medische onderzoeker spreken om een manier te onderzoeken om tijdige weefsels te ontvangen zonder afbreuk te doen aan de verantwoordelijkheid van de medische examinator. Als er levensvatbare weefsels aanwezig zijn, wordt schriftelijke toestemming verkregen (indien niet voor het slachten verkregen) en worden preparaten gemaakt voor het vervoer van het lichaam. Een eerder gecontracteerde decedent-transportdienst wordt vervolgens gecontacteerd voor transport naar de MRI-faciliteiten in de Cleveland Clinic. Zorg wordt besteed om ervoor te zorgen dat het lichaam op kamertemperatuur blijft en niet in de koeling wordt geplaatst, omdat lagere lichaams temperaturen gepaard gaan met veranderingen in de kenmerken van het MRI-signaal.

Klinische geschiedenis
Klinische geschiedenis bevat informatie over de diagnose van MS, aanvang van de symptomen, gebruikte behandelingen, resultaten van klinische en para-klinische testen (evoked potentials, cerebrospinale vloeistof resultaten, optische coherentie tomografie), multiple sclerose functionele composiet en uitgebreide invaliditeits status schaal (EDSS; feitelijk of geschat), die worden verzameld uit het medische dossier (indien beschikbaar) en direct interview van Next of kin. Ook wordt een pre-mortem MRI verzameld.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Cleveland Clinic Institutional Review Board en volgt richtlijnen van de Cleveland Clinic Human Research Ethics Committee.

1. in situ MRI

  1. Neem het donor lichaam mee naar de MRI-Suite en voer een 2 h MRI Imaging protocol uit bij de MS Imaging Facility. Voer een MRI uit op een 3 T of 7 T Imager.
    Opmerking: Er wordt prioriteit gegeven aan 3T omdat de meeste verouderde gegevens op 3 T zijn uitgevoerd, maar wanneer deze niet beschikbaar zijn, wordt Imaging uitgevoerd met 7T. Aangewezen kern sequenties worden uitgevoerd voor alle gevallen (tabel 1) en aanvullende sequenties die afhankelijk zijn van de huidige onderzoeksinteresses worden uitgevoerd als de tijd het toelaat (beperkt door het bereiken van weefsel fixatie minder dan 12 h na de dood). Tabel 1 beschrijft de kern sequenties.

2. autopsie

Opmerking: Na de in-situ MRI wordt het lichaam getransporteerd naar de mortuarium voor hersenen en ruggenmerg extractie door een Diener en weefsel verwerking door lableden.

  1. Voer de volgende stappen uit voorafgaand aan de Body aankomst in de Morgue. Twee uur vóór, bereiden 3 L van 4% Paraformaldehyde (PFA) en etiket containers en zakken voor weefsel opslag. Bereid 3 L van 8% PFA en Verdun 1,5 L van 8% PFA tot 4% PFA. Plaats de resterende 8% PFA in 4 °C voor dag 2.
  2. Voorafgaand aan het reizen naar de Morgue, vul 2 reizende koelers tot 50% capaciteit met droogijs (grote blokken gebroken om te passen en kleine pellets).
  3. Vul in de Morgue een roestvrijstalen container halverwege met 2-methylbutaan en droogijs en dek af met een deksel ter voorbereiding op snap bevriezing van het weefsel.
  4. Weeg en foto van de hersenen eenmaal verwijderd door de Diener.
  5. Plaats een bevestigde Dura in een container gevuld met PFA.
  6. Scheid het cerebellum en de hersenstam van het hersenen en fotografeer de hersenen.
  7. Identificeer de optische zenuwen, Chiasme, en Tracts en scheiden met behulp van een sonde en pincet. Resect de structuur met een scalpel.
    Opmerking: Het distale segment van één kant van de oogzenuw is gemarkeerd met behulp van Higgins Ink voor identificatie.
  8. Scheid de hersenhelften longitudinaal en foto elke halfrond afzonderlijk.
  9. Inkt de primaire motor cortex (PMC) voor de linker halfrond, re-fotograferen, en plaats het in een 3,3 L container voor langdurige fixatie. Documenteer de starttijd voor hersen fixatie.
  10. De PMC voor de rechter hemisfeer kan worden geïnkt of uitgesneden.
    1. Als het wordt uitgesneden, Verwijder eerst de bekledings hersenvliezen.
    2. Opnieuw fotograferen geïnkt of uitgesneden PMC.
    3. Als PMC wordt uitgesneden, snijd dan in 6 secties van gelijke grootte.
    4. Inkt het rostrale migratoire-aspect van elke sectie.
    5. Plaats oneven genummerde secties in met PFA gevulde containers voor korte fixatie.
    6. Maak even genummerde secties in de vriezer en plaats ze in verzegelde diepvrieszakken in koelere #1.
  11. Snijd de rechter hemisfeer voorste naar posterieure in 1 cm dikke coronale secties.
    1. Document Grove afwijkingen (bijv. Snij artefact, bloeding en laesies).
    2. Plaats oneven genummerde secties in containers gevuld met PFA voor korte fixatie.
    3. Even genummerde delen en plaatsen in verzegelde diepvrieszakken.
    4. Document einde van de hersen fixatietijd.
  12. Scheid de hersenstam van het cerebellum en plaats in een met PFA gevulde container voor korte fixatie.
    1. Afzonderlijke cerebellaire hemisferen longitudinaal.
    2. Snijd elke halve bol in 4 even dikke sagittale secties.
    3. Foto mediale en laterale views.
    4. Plaats linker cerebellaire hemisferische schijfjes in een container gevuld met PFA voor korte fixatie.
    5. Klik op de juiste cerebellaire-hemisferische schijfjes en plaats ze in verzegelde diepvrieszakken in koelere #1.
  13. Verkrijg het ruggenmerg met zenuwwortels van de Diener.
    1. Verwijder het ruggenmerg dura mater en sla Dura op in een container met PFA.
    2. Scheid de linker-en rechter anterieure en posterieure zenuwwortels. Snijd de linker anterieure en achterste zenuwwortels gesneden uit het ruggenmerg en plaats in een gevulde PFA container voor korte fixatie.
    3. Snijd de rechter voorste en achterste zenuwwortels van het ruggenmerg, snap-Freeze, plaats in verzegelde diepvrieszakken, en plaats vervolgens in koelere #2.
    4. Foto van de caudal-meest 20 cm van het ruggenmerg. Documenteer de locatie van de lumbale uitbreiding.
    5. Snijd 2 cm dwarsdoorsneden van het snoer van caudal naar rostral.
    6. Inkt het rostrale migratoire-aspect van elk snijgedeelte af.
    7. Plaats oneven genummerde secties in containers gevuld met PFA voor korte fixatie.
    8. Maak de even genummerde secties in de vriezer, plaats ze in verzegelde diepvrieszakken en plaats ze in koelere #2.
    9. Documenteer de begintijd voor fixatie van het ruggenmerg en eventuele grove afwijkingen.
    10. Fotografeer het overgebleven rostrale migratoire gedeelte van het ruggenmerg.
    11. Documenteer de positie van de cervicale uitbreiding. Volg de stappen 2.13.5 – 2.13.8 voor het overgebleven ruggenmerg.
  14. Na de mortuarium plaats bevroren weefsel in gelabelde dozen in-80 °c vriezers. Bewaar vast weefsel bij 4 °C.
  15. Bij 24 uur post-autopsie (dag 2) verdunt u de resterende 8% PFA tot 4%.
  16. Vervang 4% PFA in fixatie containers met vers verdunde 4% PFA.
  17. Bij 60 h post-autopsie bereid oplossingen van 2,5% Glutaaraldehyde in 4% PFA van Glutaaraldehyde, PFA, dH2O en sorenslo's buffer (bereid door het mengen in volgorde: 0,2 M fosfaatbuffer pH 7,4, polyvinylpyrolidon 1% w/v, sucrose 30% w/v, en ethyleenglycol 30% v/v).
  18. Verwijder gebruikte 4% PFA van Short-fixatie containers.
  19. Spoel het weefsel af in de buffer van Sorenson en plaats het in cryoprotectie oplossing (glycerol 20%, 0,4 M Sorenser's buffer 20% en 0,02% natrium natriumazide in dH2O).
  20. Fotograferen van korte-vaste hersen sneden, cerebellum, hersenstam en motorische cortex (indien van toepassing).
  21. Met een scalpel blad gesneden 2 mm dikke dwarsdoorsneden van elk 2 cm korte-vaste ruggenmerg sectie.
  22. Plaats secties in 2 ml Scintillatie flesjes en vul met oplossing van 2,5% Glutaaraldehyde in 4% PFA.
  23. Retourneer het resterende gedeelte naar de originele 20 ml Scintillatie injectieflacon. Spoel de sectie af met de buffer van Sorenson en vervang de cryoprotection-oplossing.

3. pathologie

Opmerking: Korte-vaste segmenten van de rechter hemisfeer evenals de lang vaste linker hemisfeer (geplaatst in 4% PFA gedurende enkele maanden) worden ofwel gesneden in 30 μm secties (aangeduid als vrij drijvend) of ingebed in paraffine en gesneden als 12 – 14 μm secties (aangeduid als paraffine-ingebed). Deze secties worden gewoonlijk verwerkt met proteolipide eiwitten (PLP) voor het opsporen van demyelinerende laesies en belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC-II) voor immuunactiviteit met behulp van de methode diaminobenzidine (DAB). Deze protocollen zijn gestandaardiseerd en gebruikt in verschillende publicaties2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.

  1. Vrij zwevende (30 μm) DAB-Avidin-Biotine complex (ABC) weefsel kleuring
    1. Verwijder secties van cryozak oplossing, Transfer secties naar een zes-well plaat, en was ze 3x voor 5 min elk in 2 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,0 (PBS). Bij het overbrengen naar de volgende put in de zes-goed plaat gebruik zorg niet om het weefsel te scheuren. Plaats tijdens elke was-en incubatie stap de zes-put plaat op een shaker en laat het weefsel zachtjes schudden.
      Opmerking: Weefsel secties geïnineerd in kleinere volumes en in grotere platen (dat wil zeggen, 12-en 24-goed platen) vertonen de neiging om oppervlakte-en rand scheuren.
    2. Voer geen antigeen-opvraging uit in een glazen bekerglas met ongeveer 30 mL 10 mM citraat buffer (pH 6,0). Zorg ervoor dat weefsels niet worden gevouwen door te manipuleren met een penseel en magnetron secties voor 2 – 3 min of totdat citraat buffer komt begint te koken. Laat secties afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 min).
    3. Transfer secties terug naar een 6-well plaat en wassen secties 3x voor 5 min elk in 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blokkeer endogene peroxiasen door secties in 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) te incuberen.
    4. Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blok secties in 2 mL 3% normaal geiten serum/0,3% Triton X-100/1x PBS voor 1 uur bij RT.
    5. Inbroed de delen 's nachts tot 5 dagen (afhankelijk van het antilichaam) in primaire antilichamen tegen Microglia en myeline epitopen om ontstekingen (mhcii) en demyelinisatie (PLP) te detecteren (Zie de tabel met materialen) bij 4 °c.
      Opmerking: Zorg ervoor dat secties niet worden gevouwen bij het inbroed van deze stap of volgende stappen, omdat dit zal leiden tot gebieden binnen de secties die worden vernietigd van vlek.
    6. Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Vervolgens incuberen secties in secundaire biotinyleerd antilichamen (Zie de tabel van de materialen) voor 1 h bij RT. bereid avidin-biotin complex (ABC) oplossing tijdens incubatie ongeveer 45 min voor de volgende Wash stap om ABC complexen te vormen.
    7. Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Vervolgens incuberen secties in ABC voor 1 uur bij RT.
    8. Spoel secties in 2 mL 1x PBS driemaal gedurende 5 min per stuk. Inbroed delen in gefilterde DAB (2 mL/put/sectie) die H2o2 (1:500 verdunning van 30% H2O2 in DAB) bevatten totdat de kleur adequaat ontwikkelt (~ 3 – 8 min).
    9. Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Ter verbetering van het signaal (optioneel), osmicate met behulp van 0,04% OsO4 (~ 30 s).
    10. Wassecties driemaal gedurende 5 min elk in 1x PBS. Individueel, breng elke sectie van de zes-put plaat naar een kleine container vol 1x PBS en Positioneer de weefsel sectie op een glazen glijbaan zo plat mogelijk.
    11. Til de schuif voorzichtig uit de PBS en zorg ervoor dat de weefsel sectie zo plat mogelijk is. Gebruik twee verf borstels om het weefsel op de glijbaan zachtjes af te vlakken en het overtollige water met een papieren handdoek weg te deppen. Monteer de weefsel secties met glycerol (of een gelijkwaardige bevestigings media) en sluit de Afdeklijst af met blanke nagellak.

4. paraffine-ingesloten Hemiferische delen: DAB-kleuring

  1. Smelt paraffine van de glijbanen in een 60 °C oven gedurende 5 – 10 minuten.
  2. De-paraffine delen door het inbroeren van xyleen 3x gedurende 5 min per stuk.
  3. Rehydrate weefsel in Graded ethanol bij 100% (2x voor 5 min elk), 95% (2x voor 5 min), 70% (2x voor 5 min elk), en 50% (1x voor 5 min elk). Dia's in PBS bedekken.
  4. Antigeen wordt door micro zwaaiende glijbanen in een bekerglas van 10 mM citraat buffer (pH 6,0) opgehaald.
  5. Was de glijbanen in 1x PBS (3x voor 5 min elk) eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur. Blokkeer endogene peroxiasen door weefsel in 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS gedurende 30 minuten te incuberen.
  6. Wassen weefsel in 1x PBS driemaal gedurende 5 min elk. Blok weefsel met 6% normaal geiten serum in PBS gedurende 1 uur.
  7. Inbroed delen in primair antilichaam (Zie de tabel met materialen) in PBS bij kamertemperatuur (RT) 's nachts (max. 20 uur).
  8. Was secties 3x voor 5 min elk in 1x PBS. Vervolgens inbroed delen in het overeenkomstige secundaire antilichaam (Zie de tabel met materialen) in PBS voor 1 uur bij RT.
  9. Bereid ABC-oplossing ongeveer 45 min voor de volgende wasstap tijdens de incubatie.
  10. Was secties 3x voor 5 min elk in 1x PBS en inbroed vervolgens in ABC voor 1 uur bij RT.
  11. Was sectie 3x voor 5 min elk in 1x PBS.
  12. Inbroed secties in gefilterde (0,45 μm filter poriegrootte) DAB met H2o2 (1:500 verdunning van 30% H2o2 in DAB) tot de kleur adequaat ontwikkelt (~ 3-8 min).
  13. Wassen secties (3x 5 min) in 1x PBS. Om het signaal te verbeteren, osmicate met behulp van 0,04% osmium tetroxide (OsO4; ongeveer 30 s).
  14. Wash secties (3x 5min) in 1x PBS.
  15. Dehydraat weefsel in een gesorteerde serie ethanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min) en 100% xyleen (1x 5min). Laat xylenen verdampen.
  16. Monteer secties met snelle droge bevestigings media op tolueen. Formuleringen die anti-oxidanten bevatten, worden aanbevolen om vlek bleaching te voorkomen. Verwijder overtollige bevestigings media van de schuif randen met een scheerapparaat voor daaropvolgende opslag.

5. correlaties met MRI/pathologie

Opmerking: Voor het correleren van MRI met pathologie, voeren we eerst ex vivo MRI uit van het lang vaste, intacte hersen halfrond (stap 2,9 hierboven) in een instelbare doos met MRI-zichtbare markeringen die de snij sleuven aangeven. Vervolgens snijden we de hersenen en fotograferen we de segmenten van 1 cm om de co-registratie van in-situ Mri's aan de afzonderlijke hersen segmenten mogelijk te maken. Vervolgens kunnen we MRI-geleide analyses uitvoeren, waarbij regio's van belang (ROIs) worden geïdentificeerd op MRI tot directe weefsel analyse. We kunnen ook histopathologie-geleide analyses uitvoeren, waarbij ROIs worden geïdentificeerd op weefsel (bijvoorbeeld laesies van witte stof, witte stof zonder demyelinisatie, enz.) en vervolgens worden gekenmerkt door de co-gelokaliseerde MRI-maatregelen (tabel 1).

  1. Identificatie van ROIs op basis van MRI
    Opmerking:
    in eerdere studies hebben we Rois in witte materie vastgesteld11,12,13,14,15 en grijze materie16,17, 18. het onderstaande voorbeeld is voor witte-materie analyse.
    1. Segment T2 hyperintens laesies op in situ MRIS (vanaf stap 1,1), aanvankelijk verwerkt door een automatisch algoritme, en vervolgens handmatig gecorrigeerd door ervaren gebruikers.
    2. Segment T1 intense laesies binnen T2 laesies als voxels met een signaalintensiteit van minder dan of gelijk aan 80% van de signaalintensiteit van het omringende normaal-verschijnend hersenweefsel.
    3. Segment intense gebieden in magnetisatie Transfer ratio (MTR) kaarten met een drempel van 80%.
    4. Maak drie classificaties met de bovenstaande segmentaties: (a) alleen T2-laesies die abnormaal zijn op T2-gewogen/FLAIR-scans, maar normaal op T1-gewogen of MTR-scans, (b) T2T1MTR laesies, die abnormaal zijn op alle T2-gewogen/FLAIR-, T1-gewogen en MTR-scans; en (c) normaal-verschijnend wit materiaal (NAWM), die normaal zijn op alle T2-gewogen/FLAIR, T1-gewogen en MTR-scans.
      Opmerking: Onze selectie van segmenten is gebaseerd op het bestaan van alle drie de regio's van de rente (T2-only, T2T1MTR en NAWM) op dezelfde segmenten.
    5. Bereken genormaliseerde intensiteiten voor elke ROI om variabiliteit te minimaliseren die voortvloeien uit verschillende hersenen en verschillende hersen locaties.
  2. Co-registratie van in-situ MRI naar hersen schijfjes
    1. Scan de vaste hersenhelft in een aangepaste snijden box met vier rijen MRI-gevoelige markers die de sleuven lokaliseren waar een mes kan worden ingebracht om de hersenen te snijden. Voer een T1-gewogen 3D MPRAGE overname met 1 mm isotrope resolutie die betrekking hebben op de vaste hersenen en alle van de markers.
      Opmerking: Dit wordt post-fixatie MRI genoemd en wordt alleen gebruikt als een tussenstap voor co-registratie van de in situ Mri's naar de hersen segmenten.
    2. Onmiddellijk na het scannen, snijd de hersenhelft in "slots" gelegen op 1 cm van elkaar, resulterend in ongeveer 15 segmenten.
    3. Fotografeer de hersen schijfjes op zowel de voorste als de achterste zijkanten.
    4. Co-Registreer de in situ MRI en foto's van hersen segmenten met de volgende stappen.
      1. Voor segmentatie van post-fixatie en in situ MPRAGE, pre-process zowel post-fixatie en in situ MPRAGE Mri's voor intensiteit niet-uniformiteit19.
        1. Segmenteer de hersenen en vier rijen markeringen van voorbewerkte MPRAGE na fixatie.
        2. Segmenteer de halve bol die overeenkomt met de post-fixatie MRI20,21 van de voorverwerkte in situ-mprage.
      2. Registreer de door de hersenen geëxtraheerde Mri's in situ en post-fixatie via een reeks lineaire registratieprocessen tot 12 graden van vrijheid (affiene registratie) met behulp van FSL FLIRT22. De schalen en schuintrekken onderdelen rekening voor het effect van fixatie krimp.
      3. Zoek de normale richting van het snijvlak door de som van de maximale geprojecteerde intensiteiten te minimaliseren met behulp van gesegmenteerde markeringen. Deze heroriënterings hoeken zijn opgenomen in de transformatie matrix die is verkregen uit de vorige stap.
      4. Visueel overeenkomen met MRI-beelden op foto's van vaste posterieure hersen segmenten met behulp van een in-House beeldviewer die het mogelijk maakt om de diepte en oriëntatie van de normale vectoren te veranderen. Kleine aanpassingen zijn nodig omdat de hersen snijden onvolmaakt is.
      5. Breng affiene beeld transformatie13 aan voor elk segment om de in-situ mri's te transformeren naar dezelfde snijden-locaties als de foto's van de hersen segmenten.

Representative Results

Zoals hierboven vermeld, is bijna de helft van de hersenhelft bevroren en beschikbaar voor moleculaire studies met behulp van DNA, RNA of eiwitten. In het verleden is aangetoond dat studies met postmortemen hersenweefsels worden beïnvloed door pre-mortem condities, leeftijd, geslacht, weefsel pH, mRNA-integriteit (RIN), postmorteminterval (PMI), diagnostische zekerheid, gebruik van comorbidstoffen en voorafgaande medicatie behandeling. status23. Gebaseerd op studies met behulp van hersenweefsels, DNA en eiwitten lijkt te worden beïnvloed in mindere mate in vergelijking met RNA. Op basis van onze ervaring zijn RNA-isolatie en downstreamanalyse echter het meest getroffen door de pre-mortem condities en het postmorteminterval van het hersenweefsel. Daarom bespreken we enkele van de voorwaarden die moeten worden gevolgd voor het uitvoeren van RNA-gebaseerde analyse met behulp van postmortemms weefsels.

Voor al onze studies, nadat de hersenen worden verzameld bij autopsie, wordt het gesneden (1 cm dik) en vervolgens ofwel vastgesteld in 4% Paraformaldehyde voor morfologische studies of snel bevroren voor biochemische analyse. Alle weefsel blokken worden gekenmerkt voor demyelinisatie door immunokleuring met de PLP zoals hierboven beschreven. Een representatieve analyse regeling wordt weergegeven in Figuur 1. Weefsel secties worden onderzocht op de aanwezigheid van witte-stof laesies (Figuur 1a). Geselecteerde gebieden zijn gekleurd voor immuunactiviteit (Figuur 1b) en demyelinisatie (figuur 1c). Het bevroren weefsel is gemonteerd op de cryostaat (figuur 1d) en bevroren 30 μm secties worden afgesneden. Dit wordt gevolgd door het verzamelen van 3-4 daaropvolgende secties, scheiding van de aangrenzende weefsels en opslag voor DNA-, RNA-of eiwit isolatie. Met dit protocol hebben we DNA24,25, RNA5,6,7,8,9 en eiwitten26met succes geïsoleerd. Hoewel belangrijke bevindingen van sommige van de onderzoeken die RNA van MS-hersenen analyseren, hier worden besproken, zijn hier enkele van de kwesties die verband houden met de analyse van RNA-postmortemorms-hersenen.

Figure 1
Figuur 1: monsterverzameling voor mRNA-analyse. A) het autopsie weefsel wordt geselecteerd voor analyse. Gebieden van weefsel worden geselecteerd en een deel van het weefsel wordt weggesneden. Alle secties zijn gekleurd met (B) MHC-II (Major histocompatibility complex (MHC) klasse II HLA-Dr CR3/43) antilichamen voor het opsporen van ontstekings activiteit en met (C) proteolipide eiwitten (PLP) om de status van myeline te bepalen met behulp van gepubliceerde protocollen. Op basis van de myeline status wordt het blok gescoord door een scalpel (D). Secties (60 μm) worden gesneden (E) en de gebieden die eerder zijn gescoord, worden verwijderd, gescheiden in buizen en gelabeld (F). De PLP en MHC-II vlekken worden herhaald na elke 5 secties om een juiste inzameling van weefsel te garanderen. Normaal verschijnend wit materiaal (NAWM) wordt opgemerkt en witte stof laesies (WML) worden in het rood geschetst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Axonale transect in de laesies van MS10. Een eerste wetenschappelijke focus van dit programma lag op de karakterisering van cellulaire componenten van gedemyelineerde witte-materie laesies. Onder de antigenen gelokaliseerd was niet-fosforyleerd neurofilamenten (NFs). De meeste NFs zijn gefosforyleerd in myelinehoudende axonen. Na demyelinisatie worden axonen gedefosforyleerd. We hebben de verwachte expressie van niet-gefosforyleerd NFs in gedemyelineerde axonen gedetecteerd. Bij acute MS laesies eindigden veel van deze gedemyelineerde axonen als axonale terugtrek lampen (Figuur 2a), die de proximale uiteinden van sneden axonen weerspiegelen. Transected axonen overschrijden 11.000 mm3 in de acute laesies in vergelijking met aangrenzende normale gebieden10. Deze observaties hielpen bij het katalyseren van een paradigmaverschuiving in MS onderzoek dat het veld verplaatst naar het karakteriseren van neurodegeneratie als de belangrijkste oorzaak van permanente neurologische handicap bij personen met MS.

Figure 2
Figuur 2: axonale transectie tijdens inflammatoire demyelinisatie. Axonale transect treedt op tijdens inflammatoire demyelinisatie (a, pijlpunten) en induceert de vorming van terminale ovoïden (a, pijlen). Wanneer gekwantificeerd (B), sneden axonen zijn overvloedig in MS laesies en lijken te correleren met inflammatoire activiteit van de laesie. Panel A gereproduceerd van Trapp et al.10 met toestemming. Rood: proteolipide proteïne, groen: anti-fosforylated Neurofilament. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Remyelinisatie bij chronische MS hersenen3. Remyelinisatie kan robuust zijn tijdens vroege stadia van MS. Veel chronische MS laesies zijn echter niet remyelineerd. We onderzochten of de aanwezigheid van Oligodendrocyt voorlopercellen (OPCs) of het genereren van nieuwe oligodendrocyten de remyelinisatie van chronisch demyelfluorwitte-Matter laesies beperkt. Hoewel de OPC-dichtheid vaak daalde, waren ze aanwezig in alle chronisch-demyelfluorlaesies3. Nieuw gegenereerde oligodendrocyten waren ook aanwezig in vele chronische MS laesies. Oligodendrocyten processen in verband met, maar niet myelinaat-demyelgefluoreerde axonen (Figuur 3). Deze studies geven aan dat OPCs en hun vermogen om nieuwe oligodendrocyten te produceren niet beperken remyelinisatie van chronische witte-materie laesies. We veronderstelde dat de chronisch-gedemyelineerde axonen, die vaak dystrofische leken, niet ontvankelijk waren voor remyelinisatie door nieuw geproduceerde oligodendrocyten.

Figure 3
Figuur 3: processen van pre-myelinerende oligodendrocyten geassocieerd met axonen. Confocale micro foto's van MS laesies die gekleurd zijn met antilichamen van de PLP (rood in panelen a, b) en Neurofilament antilichamen (groen in panelen a, b) worden getoond. Een pre-myelinerende Oligodendrocyt (rood in paneel A) in de subventriculaire zone (SVZ) verlengde processen in het gebied van gedemyelineerde axonen (groen in paneel A) in een chronische MS laesie. Veel van deze processen (pijlen in paneel A) spiraalsgewijs rond axonen, zoals getoond bij een hogere vergroting (panel B). Schaal staven vertegenwoordigen 20 μm (A) en 5 μm (B). Gereproduceerd van Chang et al.3 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Mitochondriale disfunctie in MS6. We voerden een onbevooroordeelde zoektocht naar neuronale genveranderingen in snel bevroren motorische cortex verkregen van chronische MS-patiënten (figuur 4a). Een onbevooroordeelde zoektocht naar deze gegevensset identificeerde significante verlagingen in 23 met kernenergie gecodeerde mitochondriale Mrna's in MS (figuur 4b). Credentialing studies met behulp van immunocytochemie en in situ hybridisatie aangegeven dat deze genen waren sterk verrijkt in corticale projectie neuronen (figuur 4c) en dat mitochondriën geïsoleerd uit projectie axonen display verminderde glycolyse ( Figuur 4D). Dit papier gekatalyseerde een focus op mitochondriale dysfunctie en verminderde ATP productie als een belangrijke bijdrage aan axonale degeneratie in MS.

Figure 4
Figuur 4: Microarray data en downstream validatie technieken uitgevoerd in MS motor cortex. A) hiërarchische clustering van significant veranderde transcripten van controle (C1-C6) en SPMS (MS1-MS6) motor cortex monsters, afzonderlijk ter ondersteuning van ziektegerelateerde genexpressie patronen. Onder de verlaagde transcripten in MS motor cortex behoorde zesentwintig tot de elektronentransport keten (B). Mitochondriaal complex I (NDUFA6) mRNA werd verlaagd in neuronen (n = 55-130) in MS motor cortex (CII) in vergelijking met controle (CI), terwijl de mRNA-DICHTHEDEN van de PLP vergelijkbaar waren tussen controle (CIII) en MS (CIV) cerebrale cortex. Activiteit van elektronentransport complexen I en III werden verlaagd in mitochondriale verrijkte fracties uit de motorische cortex van MS-patiënten (n = 3) (D). Herdrukt van Dutta et al.6 met toestemming. Foutbalken vertegenwoordigen SEM; Schaalbalk in CI-IV zijn 25 μm. * p < 0,05 studenten t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Pathogenese van cognitieve disfunctie in MS8. 40 tot 60% MS patiënten hebben cognitieve achteruitgang en verminderde uitvoerende functie. We identificeerden de hippocampus, dat is een functionele plaats van geheugen/leren, als een gemeenschappelijke site voor demyelinisatie in MS. We vervolgens vergeleken neuronale genexpressie in myelfluoren demyelineerde hippocampi en vond aanzienlijke verlagingen in neuronale mRNAs coderen van eiwitten die betrokken zijn bij het geheugen/leren. We hebben deze gegevens uitgebreid door aan te tonen dat bepaalde Microrna's worden verhoogd in demyelineerde Hippocampus en dat deze microRNAs de expressie van glutamaatreceptoren kan verminderen. We hebben deze waarnemingen in knaagdieren modellen gereproduceerd en uitgebreid. We vervolgens vergeleken neuronale genexpressie in myelfluoren demyelineerde hippocampi en vond aanzienlijke verlagingen in neuronale mRNA codering eiwitten die betrokken zijn bij het geheugen/leren.

Figure 5
Figuur 5: weefsel inzameling, histologische analyse en genexpressie studies bij MS Hippocampus. Hersen schijfjes met Hippocampus worden geselecteerd tijdens autopsie (a) en de hippocampus en aangrenzende regio wordt verwijderd (rode doos) voor verdere analyse. Immunokleuring voor de PLP toonde behoud van myeline in alle controle (B) en 40% van mevrouw hippocampi (C). Uitgebreide demyelinisatie werd aangetroffen in ~ 60% van de MS hippocampi (D). In vergelijking met de controle hippocampi (E, G, I), significante neuronale verlies werd niet gedetecteerd in Ca1, Ca3, of Ca4 regio's van demyelgefluoreerde MS hippocampi (F, H, J) zoals aangetoond door Hur immunohistochemie. Het dubbel labelen van immunofluorescentie voor myeline (myeline Basic protein (MBP), Green) en axonen (SMI32, Red) toonde verlies van myeline (L) met relatief behoud van axonen (N) in MS demyelgefluoreerde Hippocampus in vergelijking met Control Hippocampus ( MBP, K; SMI32, M). Dubbele clustering van mRNA-uitdrukkings niveaus regelde samples in discrete clusters op basis van myeline-status (myelgefluoreerde en gedemyelineerde) en locatie (Hippocampus vs. motorische cortex) (O). Hoge mRNA-niveaus worden aangegeven door rood en blauw duidt op lage uitdrukkings niveaus. Panelen C-O aangepast van Dutta et al.8 met toestemming. B-D: 2 mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Pathologische correlaten van MRI-veranderingen12. Hoewel MRI een gewaardeerde indicator is van MS-diagnose en-respons op de behandeling, en ook een voorspeller is van de progressie van de ziekte van MS, zijn de pathologische correlaten van MRI-veranderingen slecht begrepen. Onze postmortem MRI-onderzoeken hebben zich geconcentreerd op twee MRI-ROIs. Cerebrale wit-materie Rois die alleen T2 hyperintens waren (T2 alleen) en Rois dat had een combinatie van T1 hypointensity, T2 Hyper intensiteit, en verminderde magnetisatie Transfer ratio (MTR) (T2T1MTR). Ongeveer 45% van de cerebrale witte ROIs (T2-only) was myelgefluoreerd en bevestigde de niet-specifieke aard ervan. 83% van de T2T1MTR ROIs was daarentegen chronisch gedemyelineerd en verscheen als zwarte gaten. T1-en MTR-waarden zijn semi-kwantitatief en hun waarden varieerden uitgebreid in de T2T1MTR ROIs. Als verlies van myeline de enige bijdrager is aan deze MRI-veranderingen, dan moeten de waarden constant zijn. Gezwollen gedemyelineerde axonen gecorreleerd met zowel T1-als MTR-waarden.

Figure 6
Figuur 6: magnetisatie overdrachts ratio's (MTR) en T1 contrastverhoudingen lineair correleren met het percentage van na+/k+ ATPase-positieve AXONEN bij chronische MS laesies. Chronisch-demyelfluorlaesies gekleurd voor na+/K+ ATPase (groen) varieerden van bijna 100% (a) tot nul (B) in Neurofilament (rood). Veel axonen zonder na+/K+ ATPase hadden een verhoogde diameter (B). Een vergelijking van het percentage na+/K+ ATPase-positieve axonen in chronisch-DEMYELGEFLUOREERDE MS laesies gecorreleerd met kwantitatieve postmortem MTR (p < 0,0001, C) en T1 contrastverhoudingen (p < 0,0006, D). Elk gegevenspunt is van een enkele laesie en elke unieke kleur-symbool combinatie duidt op een van de hersenen bestudeerd. Schubben staven = 5 μm. gereproduceerd van Young et al.12 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Neurodegeneratie onafhankelijk van demyelinisatie11. Historisch gezien, neurodegeneratie in MS is gedacht te resulteren uit demyelinisatie. Hersen beeldvormings studies hebben echter de kans gewekt dat neurodegeneratie en demyelinisatie onafhankelijke gebeurtenissen kunnen zijn. We hebben onlangs een subpopulatie van MS-patiënten geïdentificeerd die demyelinisatie van het ruggenmerg en de hersenschors hebben, maar niet van de cerebrale witte stof. We bedacht dit subtype van MS als myelocorticale MS (MCMS). MCMS cases voorzag in een platform om de relatie tussen cerebrale witstof demyelinisatie en corticale neuronale verlies te onderzoeken. Vergeleken met controle cortices was het corticale neuronale verlies significant groter in MCMS cortices dan bij typische MS-cortices. Controle hersenweefsel werd verkregen van de afdeling Pathologie in de Cleveland Clinic. Deze studie verschaft het eerste pathologische bewijs voor neurodegeneratie bij afwezigheid van demyelinisatie.

Figure 7
Figuur 7: neuronale verlies bij afwezigheid van cerebrale witstof demyelinisatie. Een door Cresylacetaat Violet gebeitst coronale hemisferische sectie van een individu met een typische MS (a). Neuronale dichtheden werden in elk van de vijf gelabelde gebieden vergeleken in de corticale lagen III, V en VI. Neuronen met een oppervlakte groter dan 60 μm2 (geel) worden weergegeven in een representatief beeld uit de superieure temporale cortex (B). Etikettering voor de PLP en de verdeling van demyellesies (witstof demyelinisatie wordt blauw gemarkeerd; subpiale demyelinisatie wordt in het roze gemarkeerd) in hemiferische gedeelten van individuen met typische MS (C) en myelocorticale MS (D ) worden weergegeven. Een significante correlatie tussen verminderde corticale neuronale dichtheid en verhoogd cerebrale witstof laesievolume werd gevonden in typische MS, maar niet in myelocorticale MS (E); onderbroken lijnen geven 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) aan. IFG = inferieure frontale gyrus. STG = superieure temporale gyrus. INi = inferieur Insula. INs = superieur Insula. CG = cingulate gyrus. Overgenomen van Trapp et al.11 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Duur van de sequentie Sequentie beschrijving Volgorde gebruik
0:09 Localizer Lokalisatie voor opeenvolgende sequenties
9:14 3D magnetisatie voorbereide snelle gradiënt echo (MPRAGE) Structurele beeldvorming volumetrische schatting van hersenstructuren
5:14 3D vloeistof verzwakte inversie herstel (FLAIR) Laesie identificatie laesie segmentatie volumetrische laesie beoordeling
2:35 2D T2 gewogen Laesie identificatie laesie segmentatie volumetrische laesie beoordeling
5:12 3D gradiënt-opgeroepen echo met magnetisatie Transfer pre-Pulse, (MT-on) Vermeende maatstaf van myeline gehalte in normaal verschijnend en lesional weefsel
5:12 3D gradiënt-opgeroepen echo zonder magnetisatie Transfer pre-Pulse, (MT-off)
0:27 DTI-veldtoewijzing (diffusie tensor Imaging) Meting van de water diffusie in hersenweefsel dacht aan de integriteit van het hersenweefsel weerspiegelen.
10:27 Diffusie tensor Imaging (DTI) multi-shell
1:18 Diffusie tensor Imaging (DTI) multi-shell
39:48:00 SUBTOTAAL: KERN

Tabel 1: postmortem beeldvormings protocol.

Discussion

We beschrijven een protocol dat is gebruikt voor het snel aanschaffen en verwerken van weefsel van meer dan 150 individuen met MS. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is dat de wetenschappers die het weefsel gebruiken ook belast zijn met het tot stand brengen van het protocol en het uitvoeren van de weefsel verzameling. Dit biedt flexibiliteit bij het voldoen aan de wetenschappelijke behoeften van individuele onderzoeksprojecten. Verschillende aspecten van dit protocol verbeteren het nut ervan. De patiënten zijn meestal goed gekarakteriseerd vóór de dood, omdat velen van hen zijn gevolgd door neurologen in ons centrum. Een kritieke stap is de verwerking van weefsel donaties kort na de dood, wat de kwaliteit van het bevroren weefsel verhoogt in vergelijking met sommige andere hersen banken. Dit maakt moleculaire studies mogelijk die van grote waarde zijn bij het beschrijven van veranderingen in transcriptionele en translationele genproducten, die essentieel zijn voor de onderbouwing van histologische en immunocytochemische waarnemingen. Het gebruik van morfologische/immunocytochemische en moleculaire gegevens in meerdere gevallen verhoogt de betrouwbaarheid van de conclusies. Dit is het beste geïllustreerd door onze beschrijving van mitochondriale gen veranderingen in cerebrale cortex en neuronale gen veranderingen in demyelgefluoreerde hippocampi. Nieuwe genprofilerings protocollen worden snel ontwikkeld en het bevroren weefsel in onze bank moet kwalitatief hoogwaardig RNA bieden voor weefsel-en eencellige analyse.

Een ander waardevol aspect van ons protocol zijn de korte-vaste hersen sneden. Deze weefsels worden in 30 μm dikke, vrij zwevende delen gesneden. Deze secties zijn ideaal voor het gebruik van confocale microscopie om twee of meer antigenen in drie dimensies te analyseren. Goede voorbeelden zijn de interactie van pre-myelinerende oligodendrocyten processen met dystrofische axonen in chronische MS laesies, evenals de identificatie van enkelvoudige axonale verbindingen naar sneden axonale terugtrek lampen. Dit is in tegenstelling tot het routinematige gebruik van paraffine profielen met een dikte van 7 μm, waarbij 3D-beelden niet haalbaar zijn. Paraffine-ingesloten weefsels hebben een grote waarde voor sommige vragen, met name de kwantificering van neuronale dichtheden in hemiferische 7 μm-dikke delen. Onze weefsel verwerkingsprotocollen zijn daarom divers en bieden flexibiliteit om vaste en snel bevroren weefsels te verzekeren.

Een ander uniek kenmerk van ons protocol is de postmortem in situ hersen MRI. Hersen Mri's zijn een onvervangbaar biomarker van MS-ziekte. Het is daarom essentieel om de pathologische correlaten van abnormale MRI-signalen vast te stellen. Uit onze studies is gebleken dat zowel T2 als T2T1MTR ROIs vaak myelfluorzijn. Deze bevinding ondersteunt de behoefte aan specifiekere beeldvormings modaliteiten die betrouwbaar onderscheid maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI lijkt gevoelig te zijn voor de detectie van myeline, maar onze studies tonen aan dat zelfs een combinatie van T1/T2/MTR niet specifiek is voor het identificeren van myelinisatie. Ons postmortemprotocol biedt een ideaal platform om het vermogen van nieuwe beeldvormings modaliteiten te testen om onderscheid te maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI biedt ook het ideale voertuig voor de vertaling van elementaire wetenschappelijke resultaten in de klinische praktijk, gezien het gebruik van MRI in ons translationeel onderzoek en het wijdverbreide klinische gebruik bij levende patiënten.

Terwijl het snijden van korte-en lang-vaste en bevroren segmenten een voordeel biedt voor het verwerken van weefsel in meerdere modi voor verschillende studies, zijn er enkele beperkingen met deze methode. De beoordeling van het geheel van een structuur kan worden beperkt, aangezien gedeelten ervan verschillend kunnen worden verwerkt op aangrenzende segmenten. Het grote volume van de weefselbank biedt echter de mogelijkheid om een structuur van belangstelling voor meerdere proefpersonen te onderzoeken om de bemonstering te verbeteren. Een andere algemene beperking van onderzoeken met behulp van postmortemweefsels is dat ze cross-sectional zijn. De conclusies met betrekking tot de timing en de voortgang van de veranderingen moeten in deze context worden geïnterpreteerd. Er kan een selectie bias zijn voor patiënten die hun weefsels doneren, wat de generalisatie van gegevens kan beperken tot alle patiënten met MS. Aangezien de meeste donoren sterven aan complicaties van gevorderde MS, is het wellicht niet gepast om de bevindingen van deze patiënten te extrapoleren naar die in eerdere stadia van MS. Desalniettemin hebben we weefsels ontvangen van jongere patiënten die zijn gestorven aan niet-MS-gerelateerde aandoeningen (d.w.z. acuut myocardinfarct, overdosis drugs, zelfmoord). Het toepassingsgebied van ons protocol omvat geen bemonstering van andere organen (bijv. gastro-intestinale en beenmerg) die bij MS betrokken zijn geweest. Wij geloven dat de sterke punten van het programma sterk opwegen tegen de beperkingen.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs willen ook Dr. Christopher Nelson bedanken voor de redactionele hulp. Het autopsie programma wordt deels ondersteund door R35 Grant NS097303 aan BDT. Het werk in het laboratorium van RD wordt ondersteund door beurzen van NINDS (NS096148) en de National Multiple Sclerose Society, VS (RG 5298).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG Vector Laboratories BA-9200 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1000 1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG Vector Laboratories BA-9400 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP) Dako Z0334 1:700 dilution for hemispheric.
RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone Santa Cruz SC-5261 1:500 for 30µm free floating.
RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 Dako Mo746 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating.
RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) Biolegend 801701 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31) Biolegend 801601 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP) Gift from Wendy Macklin 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper Whatman 1452-125 For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 Electron microscopy grade.
Cytoseal ThermoScientific 8310-16
Ethylene glycol Fisher Chemical BP230-4
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore-Sigma SLHV033RB
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19200 Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) Fisher Chemical BP220-212
Sodium azide Fisher Chemical S227I 2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S0876 98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose Sigma-Aldrich PVP40-500G
VectaStain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100 1:1,000 dilution of A and B.
RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink Higgins 44201
Xylene Fisher Chemical X3S Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS Siemens Healthineers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder? Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).
  2. Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions. Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).
  3. Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).
  4. Chang, A., et al. Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis. Brain. 131, 2366-2375 (2008).
  5. Chang, A., et al. Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).
  6. Dutta, R., et al. Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).
  7. Dutta, R., et al. Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients. Brain. 130, 2566-2576 (2007).
  8. Dutta, R., et al. Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).
  9. Dutta, R., et al. Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors. Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).
  10. Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).
  11. Trapp, B. D., et al. Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study. Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).
  12. Young, E. A., et al. Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).
  13. Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).
  14. Moll, N. M., et al. Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis. Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).
  15. Moll, N. M., et al. Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations. Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).
  16. Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).
  17. Chen, J. T., et al. Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS. Neurology. 80, 246-252 (2013).
  18. Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm. Neuroimage. 54, 278-289 (2011).
  19. Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data. IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).
  20. Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking. Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. 19-25 (1997).
  21. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. Neuroimage. 17, 825-841 (2002).
  23. Lewis, D. A. The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders. Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).
  24. Chomyk, A. M., et al. DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus. Scientific Reports. 7, 8696 (2017).
  25. Huynh, J. L., et al. Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains. Nature Neuroscience. (2014).
  26. Ishii, A., et al. Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin. Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics