Elektrofysiologiske undersøgelser af Retinogeniculate og Kortikogeniculate synapse funktion

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi protokoller for fremstilling af akutte hjerne skiver, der indeholder den laterale geniculate kerne og den elektrofysiologiske undersøgelse af retinogeniculate og kortikogeniculate synapser funktion. Denne protokol giver en effektiv måde at studere synapser med den høje frigivelse og lav frigivelse sandsynlighed i de samme akutte hjerne skiver.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den laterale geniculate Nucleus er den første relæstation for den visuelle information. Relæ neuroner i denne thalamic Nucleus integrerer input fra retinal ganglion celler og Projicer det til den visuelle cortex. Derudover modtager relæ neuroner top-down excitation fra cortex. De to vigtigste excitatoriske input til relæ neuroner adskiller sig i flere aspekter. Hver relæ neuron modtager input fra kun nogle få retinogeniculate synapser, som er store terminaler med mange udgivelses steder. Dette afspejles af den sammenligneligt stærke excitation, relæ neuroner modtage, fra retinal ganglion celler. Kortikogeniculate synapser, i modsætning, er enklere med få frigivelse sites og svagere synaptisk styrke. De to synapser adskiller sig også i deres synaptiske kortsigtede plasticitet. Retinogeniculate synapser har en høj frigivelse sandsynlighed og dermed vise en kortvarig depression. I modsætning hertil har kortikogeniculate synapser en lav frigivelse sandsynlighed. Kortikogeniculate-fibre krydser de retikulære thalamic-kerner, før de går ind i den laterale geniculate-kerne. De forskellige placeringer af den retikulære thalamic-kerne (rostrally fra den laterale geniculate-kerne) og optisk kanal (ventro-sideværts fra den laterale geniculate-kerne) gør det muligt at stimulere kortikogeniculate eller retinogeniculate synapser separat med ekstracellulære stimulations elektroer. Dette gør den laterale geniculate Nucleus en ideel hjerne område, hvor to excitatoriske synapser med meget forskellige egenskaber, der påvirker den samme celletype, kan undersøgt samtidigt. Her beskriver vi en metode til at undersøge optagelsen fra relæ neuroner og til at udføre detaljeret analyse af retinogeniculate og kortikogeniculate synapse funktion i akutte hjerne skiver. Artiklen indeholder en trin-for-trin-protokol til generering af akutte hjerne skiver af den laterale geniculate Nucleus og trin til registrering af aktivitet fra relæ neuroner ved at stimulere optisk tarmkanalen og kortikogeniculate fibre separat.

Introduction

Relæ neuroner i lateral geniculate Nucleus integrerer og videreformidle visuelle oplysninger til den visuelle cortex. Disse neuroner modtager excitatoriske input fra ganglion celler via retinogeniculate synapser, som giver den vigtigste excitatoriske drev for relæ neuroner. Derudover modtager relæ neuroner excitatoriske input fra kortikale neuroner via kortikogeniculate synapser. Desuden modtager relæ neuroner hæmmende input fra lokale interneuroner og gabaerge neuroner i Nucleus reticularis og1. Kernen reticularis og er til stede som et skjold mellem thalamus og cortex sådan, at fibre projicerer fra cortex til thalamus og i den modsatte retning skal gå gennem Nucleus reticularis og2.

Retinogeniculate indgange og kortikogeniculate indgange viser særskilte synaptiske egenskaber3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate-indgange danner store terminaler med flere udgivelses steder9,10. I modsætning hertil viser kortikogeniculate-indgange små terminaler med enkelt udgivelses steder7. Desuden, retinogeniculate synapser effektivt drev action potentialer af relæ neuroner trods kun udgør 5 − 10% af alle synapser på relæ neuroner3,8,11. Kortikosteroider, på den anden side, tjener som en modulator af retinogeniculate transmissioner ved at kontrollere membranpotentialet af relæ neuroner12,13.

Disse to vigtigste excitatoriske input til relæ neuroner er også funktionelt forskellige. En fremtrædende forskel er den kortsigtede depression af retinogeniculate synapser og den kortsigtede lettelse af kortikogeniculate synapser3,5,8. Kortsigtede plasticitet refererer til et fænomen, hvor synaptisk styrke ændrer sig, når synapse er gentagne gange aktiv inden for en periode på få millisekunder til flere sekunder. Synaptic Release sandsynlighed er en vigtig faktor underliggende kortsigtede plasticitet. Synapser, med en lav start frigivelse sandsynlighed, vise kortsigtet lettelse på grund af ophobning af ca2 + i presynapse og dermed en stigning i frigivelse sandsynlighed observeres ved gentagen aktivitet. I modsætning hertil viser synapser med høj frigivelse sandsynlighed normalt kort tids depression på grund af nedbrydningen af klar-releasable vesikler14. Desuden, desensibilisering af postsynaptiske receptorer bidrager til den kortsigtede plasticitet i nogle high-Release sandsynlighed synapser8,15. Høj frigivelse sandsynlighed og desensibilisering af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsyre (AMPA) receptorer bidrager til den fremtrædende kortsigtede depression af retinogeniculate synapser. I modsætning hertil er sandsynligheden for lav udløsning en kortvarig lettelse af de kortikogeniculerede synapser.

I mus kommer den optiske kanal ind i den dorsale laterale geniculate-kerne (dLGN) fra det caudolaterale område, mens kortikogeniculate fibre kommer ind i dLGN rostroventrally. Afstanden mellem de to indgange giver mulighed for undersøgelse af de individuelle egenskaber af to meget forskellige excitatoriske indgange, som påvirker den samme celle. Her bygger vi på og forbedrer en tidligere beskrevet dissektion metode, hvor retinogeniculate og kortikogeniculate fibre bevares i akutte hjerne skiver3. Vi beskriver derefter den elektrofysiologiske undersøgelse af relæ neuroner og stimulering af retinogeniculate og kortikogeniculate fibre med ekstracellulære stimulerings elektroer. Endelig leverer vi en protokol til påfyldning af relæ neuroner med biocytinel og efterfølgende anatomiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgene blev godkendt af det statslige tilsyns panel for dyreforsøg i Rheinland-Pfalz.

1. løsninger

  1. Dissection-opløsning
    1. For at reducere excitotoksicitet, forberede en cholin-baserede løsning, der skal anvendes under dissektion som præsenteret her (i mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cholinchlorid, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2po4, 0,5 CaCl2, 7 mgcl2, og 25 glukose. Forbered dissektions opløsningen mindre end 1 uge før eksperimentet.
  2. Optagelse løsning
    1. Forbered en kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) opløsning indeholdende (i mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2PO4, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 mgcl2, og 25 glucose. Tilsæt 50 μM D-APV og 10 μM SR 95531 hydrobromid til at blokere N-methyl-D-aspartat (NMDA) og GABAA receptorer, hhv.
  3. Intracellulær opløsning
    1. Forbered en intracellulær opløsning, der indeholder (i mM): 35 CS-gluconat, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA og 0,1 D-600 (methoxyverapamil hydrochlorid). Justér pH-værdien til 7,3 med CsOH. Filter, aliquot, og opbevar stamopløsningen ved-20 °C indtil brug.

2. dissektion

  1. Forbered to Skive kamre, hvoraf den ene er fyldt med 100 mL af dissektions opløsningen og den anden med 100 mL optagelses opløsning. Placer de to bægre i et vandbad (37 °C) og boble løsningerne med carbogen i mindst 15 minutter før dissektion.
  2. Fyld et plastikbæger glas med 250 mL nær iskold (men ikke frosset) dissektions opløsning. Boble med carbogen mindst 15 min før brug.
  3. Fyld en plastik Petri skål (100 mm x 20 mm), hvor hjerne dissektion vil blive udført, med kold dissektion opløsning. Anbring et stykke filtrerpapir i låget på Petri skålen.
  4. Afkøl den dissektions kammer af vibratome.
  5. Anæstetize en mus med 2,5% isoflurane, f. eks, i muse buret. Så snart musen ikke reagerer på en hale knivspids, halshug musen nær den cervikale medulla og fordybe hovedet i iskold dissektion opløsning i bunden af Petri skålen.
  6. Skær huden af hovedet fra caudal til nasal og holde det sideværts med fingre for at udsætte kraniet. At tage ud forhjernen, først skære kraniet sammen med den bageste-forreste midterlinje, og derefter skåret to gange gennem den koronale sutur og lambdoid sutur (figur 1a).
  7. Fjern kraniet mellem den koronale sutur og lambdoid sutur sådan, at cerebrum er eksponeret. Skær den olfaktoriske pære og adskille forhjernen fra midthjernen med en fin klinge (figur 1b). Fjern hjernen fra kraniet med en tynd spatel og Placer den på filter papiret i låget på Petri skålen.
    Bemærk: trin 2,6 og 2,7 skal udføres så hurtigt som muligt for at reducere celledød.
  8. For at bevare integriteten af de sensoriske og kortikale indgange til dLGN i hjernen skive, adskille de to halvkugler med en parasagittal snit med en vinkel på 3 − 5 ° (figur 1c,D). Tør de to halvsfærdes mediolaterale planer ved at anbringe dem på filtrerpapiret og lim dem derefter på skæringen med en vinkel på 10 − 25 ° fra det vandrette plan (figur 1E).
  9. Placer scenen midt i metal stødpude bakken, og hæld forsigtigt resten af den iskold dissektions opløsning i buffer bakken. Udfør dette trin omhyggeligt, da en stærk hælde kan fjerne den indsatte hjerne (figur 1f).
  10. Placer buffer bakken i den isfyldte bakke, som hjælper med at opretholde den lave temperatur under dissektion. Skær 250 μm skiver med en barberkniv med en hastighed på 0,1 mm/s og en amplitude på 1 mm.
  11. Hold skiver i stald kammeret fyldt med oxygeneret dissektions opløsning ved 34 °C i ca. 30 minutter, og lad derefter skiverne restituere i optagelses opløsningen ved 34 °C i yderligere 30 minutter.
  12. Efter genvinding fjernes skiveholder kammeret fra vandbad og holder skiver ved stuetemperatur (RT), indtil de anvendes i eksperimenter.

3. Elektrofysiologi

  1. Træk pipetter med borosilicat glas kapillærer og en filament Puller. Opretholde modstanden af optagelse pipetter på 3 − 4 MΩ. Træk stimulerende pipetter ved hjælp af samme protokol, men Bryd spidsen lidt efter at trække for at øge diameteren. Fyld optagelses pipetter med den intracellulære opløsning og biocytin, mens du fylder stimulerende pipetter med optagelses opløsningen.
  2. Anbring udsnittene i optagelses kammeret, og træk kontinuerligt udsnittene med oxygeneret optagelses opløsning på RT. Kontroller alle skiver og vælg dem, der viser en intakt optisk kanal.
  3. Visualiser skive og celler med et oprejst mikroskop udstyret med infrarød differential interferens kontrast (IR-DIC) video mikroskopi.
    Bemærk: relæ neuroner er differentieret fra interneuroner af deres større Soma størrelse og mere primære dendritter (grene, der dukker op fra Soma). Interneuroner viser bipolar morfologi med en mindre Soma.
  4. Placer den stimulerende pipette på skiven, før du lappe cellen med optagelses pipetten. For at undersøge retinogeniculate synapser, Placer den stimulerende pipette direkte på optik kanalen, hvor Axon fibrene fra retinal ganglion celler er bundtet (figur 2a). For at analysere kortikogeniculate synapser, Placer den stimulerende elektrode på kernen reticularis thalami, som er rostroventrally støder op til dLGN (figur 2b).
  5. Når optagelses pipetten er nedsænket i optagelses opløsningen, skal du anvende et 5 mV-spændings trin for at overvåge pipette modstanden. Indstil Holding potentialet til 0 mV, og Annuller Forskydnings potentialet, så holde strømmen er 0 pA.
  6. Du nærmer cellen med optagelses pipetten, mens du anvender positivt tryk. Når pipetten er i direkte kontakt med cellemembranen, frigør du det positive tryk, og Indstil Holding potentialet til-70 mV. Påfør et mindre negativt tryk for at gøre det muligt for cellemembranen at binde sig til glas pipetten, således at der dannes en gigaohm-forsegling (resistens > 1 GΩ). Kompenserer pipette kapacitansen og åbner cellen ved anvendelse af negative trykimpulser.
  7. For at undersøge den synaptiske funktion skal du anvende 0,1 MS nuværende impulser (ca. 30 μA) via stimulerings pipetten. Hvis der ikke observeres synaptiske reaktioner, kan det være nødvendigt at udskifte de stimulerende pipetter. Vær forsigtig, når du placerer de stimulerende pipetter i en anden position, så den optagne celle ikke går tabt.
    Bemærk: i eksemplet optagelser vist i figur 2, synaptisk kortsigtede plasticitet blev undersøgt ved at stimulere optisk tarmkanalen eller kortikogeniculate fibre to gange med 30 MS Inter-stimulus intervaller. Forholdet mellem parret og puls (PPR) blev beregnet ved at dividere amplituden af den anden excitatoriske postsynaptiske strøm (EPSC) med den første EPSC (EPSC2/EPSC1). Hver stimulerings protokol blev gentaget 20 gange. EPSC amplitude blev målt fra gennemsnitlige strømme af de 20 sweeps. Tidsintervallet mellem hver gentagelse var mindst 5 s for at undgå kortvarig plasticitet induceret af gentagelser.
  8. Overvåg serie modstanden kontinuerligt ved at anvende et 5-mV spændings trin. Brug kun cellerne med serie modstanden mindre end 20 MΩ til analyse.

4. biocytin mærkning

  1. Vedligehold hele celle konfigurationen i mindst 5 minutter for at tillade diffusion af biocytinel i de distale dendritter.
  2. Efter optagelsen fjernes pipetten forsigtigt fra cellen, så Soma ikke ødelægges.
    Bemærk: Hvis der optages mere end én celle på en skive, bør deres Somas være tilstrækkeligt væk fra deres tilstødende celler. Sørg for, at dendritter fra forskellige celler ikke forstyrrer hinanden under billeddannelse.
  3. Forbered en 24-brønden cellekultur plade. Fyld hver brønd med 300 μL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Pas på ikke at forurenes noget med PFA, som vil være i kontakt med de skiver, der skal optages.
  4. Udsnittene fra optagelses kammeret overføres til den PFA-holdige plade med en gummi pipette og fastgør skiverne natten over. Sørg for, at pipetten altid er forhindret i at blive forurenet med PFA.
    Forsigtig: bær altid handsker og brug en kemisk hætte, når du manipulerer med PFA.
  5. Efter fastgørelse af skiver natten over i PFA, Udskift PFA med fosfat-bufferet saltvand (PBS). Udsnittene i PBS opbevares ved 4 °C ved fremtidig forarbejdning (mindre end 2 uger).
  6. Vask skiver med frisk PBS 3 gange (10 min hver vask).
  7. Bloker ikke-specifikke bindingssteder ved at inkubere udsnittene i blokerings opløsningen (0,2% ikke-ionisk overfladeaktivt stof og 5% bovint serumalbumin i PBS) i 2 timer ved RT på en orbital shaker.
  8. Kassér blokerings opløsningen. Inkubér udsnittene med streptavidin-Alexa 568 fortyndet i blokerings opløsningen (1:1000) ved 4 °C natten over på en orbital shaker.
  9. Kassér antistof opløsningen og vask skiver 3 gange med PBS i 10 minutter ved RT på en orbital shaker. Vask udsnittene med vand fra hanen før montering.
  10. Sæt skiverne fra en mus på et glas skred. Sørg for, at de farvede celler er til stede på den øverste overflade af skiverne. Absorbere vandet omkring skiver med væv og derefter lade udsnittene tørre i ca. 15 minutter.
  11. Påfør to dråber monterings medium på hvert skive. Monter en dækseddel på diaset uden at fremstille luftbobler.
  12. Opbevar de mærkede skiver ved 4 °C efter visualisering med et Konfokal mikroskop.

5. cellulær billeddannelse og genopbygning

  1. Scan udsnit med et confokal mikroskop, og brug den tilhørende software til analyse.
  2. Frem begejstre fluorescensen ved 561 nm.
  3. Billede af skiver med 0,7 numeriske blænde (NA), olie-nedsænkning mål.
  4. Juster den målrettede celle midt i visningen, og Anvend en forstørrelse på 2,5 gange.
  5. Render Z-stack datasæt til at scanne hele neuron med følgende parametre: format = 2.550 x 2.550 pixels, scanningsfrekvens = 400 Hz, Z nummer = 40. voxel størrelse var omkring 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
  6. Semi-automatisk spore neuroner ved hjælp af en neuronal rekonstruktion software (f. eks NeuronStudio). Et eksempel på et 3D-sporet relæ neuron er vist i figur 3b.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udsnitstilberedningen af dLGN, der indeholder retinogeniculate-og kortikogeniculations vejene, vises under et 4X-mål (figur 2). Axoner af nethinde ganglion celler samles i den optiske kanal (figur 2). Den stimulerende pipette blev anbragt på optik kanalen for at inducere retinogeniculate synapse-medieret strøm (figur 2a) og på Nucleus reticularis og for at inducere kortikogeniculate synapser-medieret strøm (figur 2b). Bemærk, axoner fra kortikale neuroner til LGN neuroner projekter fra cortex til thalamus Traverse Nucleus reticularis thalami. Derfor kan kortikogenicluat synapser aktiveres ved stimulering i Nucleus reticularis thalami.

Den parrede puls ratio af AMPA-receptor-medierede EPSCs er under 1, når der stimuleres optisk tarmkanalen med 30 MS Inter-stimulus interval, men over 1, når stimulere kortikogeniculate fibre med samme Inter-stimulus interval (figur 2c,D) . Den parrede puls depression af retinogeniculate synapser skyldes en høj vesikel frigivelse sandsynlighed og desensibilisering af postsynaptiske AMPA-receptorer. Den parrede impuls lempelse af kortikogeniculate synapser er i overensstemmelse med en lav vesikel frigivelse sandsynlighed16.

Figur 3a viser IR-dic billede, der viser Soma af en dlgn Relay neuron sammen med spidsen af plasteret pipette. Biocytin farvning giver os mulighed for at få et overblik over den indspillede neuron. Forskellige fra interneuroner, som har bipolar morfologi, relæ neuroner har multipolære dendritiske Dorne (figur 3b), der indeholder mere end 3 primære dendritter8,17. Tre-dimensionelle (3D) rekonstruktion af en biocytin-mærket relæ neuron blev derefter genereret som viser en radialt symmetrisk dendritiske arkitektur (figur 3c).

Figure 1
Figur 1 : Ordninger, der repræsenterer dissektion-protokollen. (A) horisontal visning af muse kraniet, der viser positionen af de oprindelige nedskæringer. Det første snit blev udført sammen med den sagittale sutur, efterfulgt af en anden to nedskæringer sammen med den koronalsektion sutur og lambdoid sutur, hhv. Stiplede linjer repræsenterer indsnit. (B) sagittal opfattelse af hele hjernen. Stiplede linjer indikerer, at cerebrum er isoleret fra den olfaktoriske pære og midthjernen. (C-D) Disse paneler viser den første skærvinkel for at adskille de to halvkugler fra henholdsvis vandret (C) og koronalsektion (D) visning. (E) koronal visning af en halvkugle på skære stadiet. Stiplede linjer angiver udsnitnings retningen. l, m, d og v repræsenterer henholdsvis laterale, mediale, dorsale og ventrale aspekter for halvkugle i paneler D og E.f) diagram af dissektions kammeret med to halvkugler på skæringen. Den stiplede pil angiver skære bladets bevægelige retning. a, p, og d repræsenterer de forreste, bageste og dorsale aspekter af den venstre halvkugle, hhv. G) ordning, der repræsenterer en korrekt skåret skive med en relativ stor del af dlgn og intakt konservering af optik kanalen. dLGN, dorsale lateral geniculate Nucleus; vLGN, ventrale lateral Nucleus; OT, olfaktoriske pære; NRT, Nucleus reticularis thalami. Paneler C, D og G er blevet modificeret fra figur 1 af Turner og salt3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skive tilberedning af dLGN, der indeholder retinogeniculate-og kortikogeniculations veje og eksempler på optagelser. (A-B) Disse paneler viser en dLGN skive med bevarelse af retinogeniculate og kortikogeniculate indgange. Stimulerings elektroden blev anbragt på optik kanalen for at aktivere retinogeniculate synapser (A) og på Nucleus reticularis og for at aktivere synapser (B). (C) AMPA-receptor-medierede epscs som reaktion på stimulering af optik kanalen to gange med 30 MS Inter-stimulus interval. (D) kortikogeniculate synapse-medierede strømninger med 30 MS Inter-stimulus-interval. Stimulering artefakter blev fjernet for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Morfologisk analyse af et relæ neuron. (A) IR-dic billede, der viser Soma af en dlgn relæ neuron med spidsen af plasteret pipette. (B) Konfokal billede af et relæ neuron mærket med biocytinel og visualiseret med streptavidin-Alexa 568. (C) tre-dimensionelle (3D) rekonstruktion af samme Neuron, der viser en radialt symmetrisk dendritiske arkitektur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en forbedret protokol baseret på en tidligere offentliggjort metode3, som giver mulighed for undersøgelse af den høje sandsynlighed for frigivelse retinogeniculate synapser og lav sandsynlighed for frigivelse kortikogeniculate synapser fra samme skive. Dette er af stor betydning, da disse to indgange interagerer med hinanden for at moduere det visuelle signal transmission: retinogeniculate indgange er den vigtigste excitatoriske drev af relæ neuroner, hvorimod kortikothalamiske indgange fungerer som en modulator, som påvirker gevinsten af retinogeniculate transmission ved at påvirke tilstanden af relæ neuroner. Som forventet, vi bemærkede, at retinogeniculate og kortikogeniculate synapser vise forskellige kortsigtede plasticitet på grund af forskellen i deres frigivelse sandsynligheder. Desuden, AMPA-receptor desensibilisering bidrager også til den stærke depression i retinogeniculate synapser9,15,16. Vi har for nylig vist, at kort tids depression er moduleret af CKAMP4416, en AMPA receptor hjælpe protein af ckamp familien, der bremser opsving fra desensibilisering af AMPA-receptorer18,19, 20. Desuden er retinogeniculate synapse-medierede nuværende amplituder højere end for kortikogeniculate synapse-medierede strømme under den samme stimulerende styrke, i overensstemmelse med de store retinogeniculate synapser med flere frigivelse sites, og relativt små kortikogeniculate synapser7,21.

Udskæring-protokollen er stort set den samme som den, der er udviklet af Turner og salt3. Nogle ændringer, der var baseret på vores erfaring forbedret skive kvalitet. Svarende til Hauser et al.22, vi brugte en cholin-baseret i stedet for en saccharose-baseret dissektion opløsning. Bedring efter dissektion blev udført ved 34 °C i skære opløsningen i 30 minutter og derefter i optagelses opløsningen i yderligere 30 minutter og ikke ved stuetemperatur. Skiver var lidt tyndere (250 μm i stedet for 400 μm). Vi dissekeret hjerner ved hjælp af en kile med en vinkel på 10 − 25 °, som letter og øger pålideligheden af udskæring procedure.

Optagelse og stimulation betingelser for undersøgelse af relæ neuron synapse funktion er stort set den samme som tidligere beskrevet af Chen og Regehr8. Aktivering af optiske tarm fibre normalt fremkalder store strømme og kan være i rækken af flere nA, når alle retinogeniculate synapser på en relæ neuroner aktiveres23. For at forhindre serie resistens fejl, især når man undersøger den maksimale strøm ved at aktivere alle retinogeniculate synapser på en relæ neuroner, Chen og Regehr brugt optagelse lav modstand pipetter (< 2 MΩ). Men for at undersøge synaptisk kortsigtede plasticitet, er det tilstrækkeligt at aktivere en eller få retinal ganglion celle axons, som fremkalder strømme, der er i intervallet 34 − 579 pA (ikke offentliggjorte resultater, Chen et al.). Mindre pipetter med en modstand mellem 3 − 4 MΩ kan derfor anvendes ved undersøgelse af retinogeniculate synapse funktion ved hjælp af svag stimulation af syns vejene. Aktivering af kortikogeniculate synapser fremkalder relativt små strømninger16. Serie resistens fejl er derfor et mindre problem ved undersøgelse af kortikogeniculate synapse funktion.

Vi her viser, at stimulering af retinogeniculate og kortikogeniculate synapser kan bruges til at undersøge kortsigtede plasticitet af AMPA receptor-medierede strømme. Den samme protokol kan anvendes til at optage NMDA Receptor-medieret nuværende24. Faktisk, en af de første indikationer, at AMPA-receptor desensibilisering bidrager til den kortsigtede plasticitet i retinogeniculate synapser kom fra eksperimenter, hvor parret-Pulse ratio af AMPA receptor-medierede strømme blev sammenlignet med parrede puls forhold af NMDA-receptor medierede strømninger. Kortikosteroider blev stimuleret ved at placere stimulerings pipetten i Nucleus reticularis og, fordi axoner af kortikale neuroner, der ophidser dlgn Relay neuroner, rejser på tværs af denne thalamiske kerne. Den samme stimulerings position kan bruges til at studere hæmmende synaptiske strømme i dLGN som vist for eksempel af Govindaiah og Cox25.

Relæ neuroner Express GABAA og GABAB receptorer. Frigivelsen af GABA aktiverer synaptisk GABAA receptorer. GABAB -receptorer, som er ekstrasynapatisk lokaliseret, aktiveres, når Nucleus reticularis og er stærkt aktiveret for eksempel under burst fyring26,27,28. Spillover af Gaba, der er normalt begrænset på grund af GABA optagelse af astrocytter, kan aktivere under intens synapse aktivering af extrasynaptic GABAB receptorer27,28. Vi blokerede ikke GABAB receptorer, fordi stimulation intensitet og hyppighed var sammenligneligt lav. Men når du undersøger kortikogeniculate synapse funktion ved hjælp af intense stimulation protokoller det kan være at foretrække at tilføje GABAB receptorer.

Optagelser af dLGN Relay neuroner kan let udføres ved brug af skiver, der er ca. 2 mm mediale fra den laterale overflade af hjernen (Begynd at indsamle ca 8th af 250 μm skiver under skæring procedure). I nogle skiver, ikke begge indgange til en given relæ neuron kan påvises, fordi en af de to veje er afskåret tæt på relæet neuron. I dette tilfælde er det normalt stadig muligt at undersøge retinogeniculate og kortikogeniculate synapser i samme skive ved at vælge forskellige relæ neuroner for hver indgang. For at registrere retinogeniculate synapse medieret strøm, ventrally placeret relæ neuroner er valgt, da den optiske tarm fibre til disse celler er mere sandsynligt bevaret end i dorsalt placeret relæ neuroner. I modsætning hertil er kortikogeniculate-indgange mere sandsynligt bevaret på relæ neuroner, der er placeret dorsalt i dlgn.

Udsnitskvalitet afgør dataenes pålidelighed. Baseret på vores erfaring, er følgende parametre afgørende for at sikre en god skive kvalitet. Køling og iltning er vigtige faktorer under dissektions proceduren. Lederen af musen skal holdes i kold opløsning umiddelbart efter halshugning af musen. Når du tager hjernen ud af kraniet, bør det nedsænkes i iskold løsning hver 3 til 4 s for at reducere celledød. På samme måde skal udsnitnings proceduren udføres ved ca. 4 °C. Desuden skal dissektions opløsning og optagelses opløsning Iles mindst 15 min før brug for at opretholde tilstrækkelig iltkoncentration. Desuden kan blokering af natrium kanaler effektivt reducere neuron-aktiviteten. Derfor, en dissektion opløsning indeholdende 37,5 mmol cholin blev brugt.

Relæ neuroner viser lav-tærskel pigge, som genereres af den forbigående ca2 + nuværende29. For at blokere spændings gated ca2 +-kanaler, tilføjede vi D-600 (methoxyverapamil) til den intracellulære opløsning. D-600 bør ikke anvendes, hvis formålet med undersøgelsen er at undersøge lavtærskel pigge i relæ neuroner. Præcisionen af helcelle spændings klemme optagelser påvirkes af plads klemme fejl. Dette tekniske problem er mere relevant for indgange, der er langt væk fra optage elektroden (således for distale synapser)30,31. For at minimere effekten af Space clamp-fejlen brugte vi en cs+-baseret i stedet for en K+-baseret intracellulær løsning. Kanaler, der er K+ gennemtrængelig (f. eks. lækage kanaler), er normalt cs+ uigennemtrængelige32. Således, brugen af en cs+-baseret intracellulær opløsning øger impedansen af cellen.

Stabil patch clamp optagelse afhænger af udvælgelsen af raske celler. Neuroner med runde Soma form, mørk farve eller hævede Soma bør undgås. Desuden er relæ neuroner skelnes fra den lokale interneuroner af deres større Soma størrelse og mere udførlige primære dendritiske Arbors. Derfor valgte vi celler, der har større Soma størrelse (større end 15 μm i diameter) og ikke-bipolar morfologi. Eksempel cellen vist i figur 3b har en symmetrisk dendritisk arkitektur og kan derfor klassificeres som relæ Neuron, der ligner Y-neuroner, som for eksempel findes i katten lgn17.

Serie resistens bør være så lille som muligt og vedligeholdes konstant. Desuden, da indgangene fra to retninger er bevaret i en skive, er det vigtigt at slippe af med interferensen mellem de to indgange. For at undgå at aktivere kortikogeniculate fibre ved optagelse af retinogeniculate synapse-medierede strømninger eller omvendt, bør den stimulerende pipette ikke placeres i dLGN, og afstanden mellem stimulering og optagelse af pipetten skal være så langt som Muligt. Desuden kræver den lange afstand mellem stimulerende og optagelses pipetter relativt intakt Axon-konservering. Derfor skal der vælges en korrekt skærevinkel for dissektion. Generelt kan der kun opnås en eller to skiver med bevarelse af to indgange fra hver halvkugle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet finansieret af den tyske forskningsfond (DFG) inden for det kollaborative forsknings Center (SFB) 1134 "funktionelle ensembler" (J.v.E. og X.C.) og forsknings tilskuddet EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
  2. Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
  3. Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510, (3), 829-843 (1998).
  4. Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
  5. Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
  6. Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
  7. Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
  8. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
  9. Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
  10. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
  11. Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
  12. Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. (1997).
  13. Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
  14. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
  15. Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
  16. Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
  17. Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
  18. von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
  19. Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
  20. Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
  21. Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
  22. Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
  23. Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
  24. Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
  25. Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
  26. Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
  27. Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
  28. Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
  29. Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
  30. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  31. White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
  32. Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics