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Articles by Andrew D. Klocko in JoVE
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成像错配修复和DNA损伤的细胞反应枯草芽孢杆菌
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
一个详细的协议是描述成像的DNA修复复合物的真正形成时间
Other articles by Andrew D. Klocko on PubMed
Post-integration Mos1 水手基因载体的埃及伊蚊的行为。
Post-integration 昆虫基因载体的行为将决定可以使用的应用程序的类型。转座子的突变、 陷印，强化剂和作为遗传传动系统中昆虫的转座因子的使用要求率较高的运转下转的转座因子元素。我们通过检查胚芽线和体细胞隐现下 Mos1 转非自治元素的调查 post-integration Mos1 水手元素在埃及伊蚊转基因的行为。虽然胚芽线移位很少有人偶尔发现体细胞隐现。只有一个单行胚芽换位事件筛选 14,000 后代后被寻回。观察到的模式移位的建议 Mos1 运动发生之间的 S 期和后期。在这里报告的数据表明 Mos1 将在 Ae 中一个有用的向量。但对于需要很高程度的矢量稳定而且将应用程序限制了使用遗传驱动器、 强化剂的陷阱或转座子标签系统中这一物种的建设中。
在冈比亚疟人类疟疾病媒蚊蚊的抗菌肽转基因的异位表达 (双翅目： 蚊科)： 对疟原虫易感性的影响。
基因改变疾病矢量地位的昆虫利用重组 DNA 技术正在考虑作为根除努力的替代方法。操纵内源性免疫应答的蚊子时空特别像难治性表型可能导致抗菌肽的抗菌肽的表达等。使用转基因技术这样中国电子商务协会有人开始 24 小时后中肠血餐后创建表达式的抗菌肽 A （中国电子商务协会) 在冈比亚疟蚊独特模式。转基因蚊冈比亚两独立行是使用 piggyBac 基因载体蚊冈比亚中国电子商务协会 cDNA 规管的白纹伊蚊埃及羧肽酶启动子控制下创建的。伯氏疟原虫感染导致转基因蚊子相比 nontransgenic 蚊子虫卵囊的数目减少了 60%。操纵的蚊子的先天免疫系统可以对其作为主机发展的疾病造成的能力产生负面影响微生物。
6S RNA 调节转录的启动子特异性是由核心启动子序列和 Sigma70 4.2 区域竞争决定的。
6S RNA sigma70 RNA 聚合酶和病毒转录绑定在许多依赖 sigma70 的宣传员，但他人逃避甚至期间的转录机制大多数由 RNA 的绑定时的固定相的调控。我们报告核心启动子元素确定此启动子特异性 ；弱下跌百分之三十五元素允许启动子是 6S RNA 敏感，并扩展-10 元同样决定除 6S RNA 抑制时共识-35 元素是存在。这两个功能一起预测数以百计的映射大肠埃希氏大肠杆菌启动子可能受到 6S RNA 抑制在平稳的阶段。基因芯片分析证实 6S RNA 依赖下调从 68%预测基因表达，它对应于包含的基因表达有 49%的映射大肠杆菌启动子和固定相在作为全球监管机构建立 6S RNA。我们还表明区域 4.2 sigma70 6S RNA 的 RNA 聚合酶交互中的关键作用。在转录过程的启动 ； 区域 4.2 绑定-35 元因此，我们建议一个 6S RNA 转录调节机制是通过结合区 4.2 sigma70 的竞争。
6S RNA 绑定到 Esigma(70) 要求 Sigma(70) 地区 4.2 的正电荷的的表面。
6S RNA 是小非编码 RNA 与西格玛 70 RNA 聚合酶和病毒转录在许多宣传员期间固定相交互。何时绑定到西格玛 70 RNA 聚合酶，6S RNA 从事活动网站西格玛 70 RNA 聚合酶相似启动子 RNA 可以作为模板 RNA 合成的 DNA 的方式。已提出 6S RNA 模仿构象的 DNA 在转录过程的启动，这表明 RNA 聚合酶与 6S 之间的接触 RNA 或 DNA 可能类似。在这里我们展示该地区 4.2 的 sigma(70) 是 6S RNA 与 RNA 聚合酶的相互作用的关键。我们定义涵盖整个地区 4.2，很大程度上侧重于此螺旋的 N-末端区域的 DNA 绑定与螺旋转螺旋图案的识别螺旋残留带正电荷扩大的绑定表面。此外，区域 4.2 负电荷的残留削弱绑定到 6S RNA，但并不同样影响 DNA 具有约束力。我们建议为启动子 DNA 和 6S RNA 上的 sigma(70) 地区 4.2 的结合点重叠但不同、 提高核心启动子元素如何有助于定义对 6S RNA 调控敏感的宣传员的有趣可能性。
芽孢杆菌枯草 Beta 夹在单独的其角色不匹配从 DNA 复制过程中的突变修复。
Beta 夹是滑动夹葛 DNA 合成所需基本复制。Beta 夹也是关键的几个其他方面的 DNA 代谢，包括 DNA 错配修复 (MMR)。枯草芽孢杆菌 dnaN5 基因编码一种突变形式的 beta 夹含 G73R 替代。DnaN5 等位基因与细胞温度敏感的缺陷在 49 度 C、 DNA 复制而增长，它们表明，孕产妇死亡率在纵容温度下的部分缺陷引起的突变频率增加。我们选择了为救出活力在 49 度 C，以确定是否可以分离 DNA 复制缺陷的 dnaN5 的抑制从 MMR 缺陷。我们孤立还原在 nonpermissive 温度的增长，同时继续维持在突变频率的增加的 dnaN5 三个的抑制。所有三个 dnaN 等位基因编码 G73R 替换以及三个新错义突变之一。孤立的错义突变是 S22P、 S181G、 E346K。其中，S181G 和 E346K 位于疏水腭裂的 beta 版夹，被占领的绑定 beta 夹的蛋白质共同站点附近。我们使用的几种方法，显示产生的每个 dnaN 等位基因的突变频率的增加链接到孕产妇死亡率的缺陷。此外，我们发现 S181G 和 E346K 允许在温度升高的增长并没有明显的影响突变频率时分开 G73R。因此，我们发现枯草 beta 夹具体残留变化分隔 beta 钳从其孕产妇死亡率方面的作用的 DNA 复制过程中的作用。
锡试验的核酸内切酶域的结构： 无牌削减。
DNA 错配修复纠正逃脱了聚合酶校对、 增加复制保真 100-到 1000 倍从细菌到人类有机体中的错误。锡试验蛋白作用中央在错配修复通过协调多个信号后由 MutS 不匹配识别的钢绞线去除的蛋白质-蛋白质相互作用。在这里我们报告的枯草芽孢杆菌锡试验的核酸内切酶域的晶体结构。结构的组织中二聚和监管子域由跨越守恒核酸内切酶母题的螺旋杆连接。额外的保守的图案拉杆周围群集和定义一个 Zn(2+) 绑定站点，是锡试验函数体内的关键。结构推出了功能强大的抑制机制，以防止意外顺手牵羊的新复制的 DNA，并允许我们提议描述如何与 MutS 和 processivity 夹相互作用可以许可核酸内切酶活性的锡试验模型。结构还提供了建议和其他角色的锡试验测试中错配修复分子框架。
错配修复原因基本 DNA 聚合酶复制叉从动态释放。
错配修复 (MMR) 纠正 DNA 聚合酶基因组复制期间发生的错误。MMR 基因组维护至关重要，其损失增加突变率几个几百倍。最近的工作表明不匹配识别蛋白 MutS 和复制 processivity 夹之间的相互作用是重要的孕产妇死亡率在枯草芽孢杆菌。为进一步了解如何将 MMR 耦合到 DNA 复制，我们审查了融合在活细胞中的绿色荧光蛋白 (GFP) 的孕产妇死亡率和 DNA 复制蛋白的亚细胞定位后增加 DNA 复制错误。我们证明基本 DNA 聚合酶 DnaE GFP 灶减少之后不匹配将纳入和损失 DnaE GFP 灶需要 MutS。此外，我们显示 MutS 和锡试验绑定 DnaE 体外，暗示 DnaE 再加上修复。我们也发现这 DnaE GFP 灶减少体内显示 DnaE GFP 疫源地的损失造成的扰动到 DNA 复制的 DNA 合成 DNA 损伤独立拘捕。我们建议 MutS 直接接触的 DNA 复制机制，导致 DnaE MMR 期间在复制叉的组织中的动态变化。我们的结果建立引人注目和亲密 MMR 与体内复制的 DNA 聚合酶复合之间的连接。
