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Articles by Lyle A. Simmons in JoVE
JoVE General
成像错配修复和DNA损伤的细胞反应枯草芽孢杆菌
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
一个详细的协议是描述成像的DNA修复复合物的真正形成时间
Other articles by Lyle A. Simmons on PubMed
DnaAcos 等位基因的大肠杆菌： 动启动由替代的 A184V 和 Y271H，从而有缺陷的 ATP 绑定和异常 DNA 复制控制引起的。
染色体 DNA 复制一级致力于此的生化途径的规定。在大肠埃希氏大肠杆菌 DnaA 蛋白的出现，规范这一进程。突变体的形式，DnaAcos，携带四个氨基酸的替换，是在响应监管信号，显然是有缺陷，因为它诱使动启动从细菌复制原点 （里奇）。在本报告中，显示为表型的动启动以是两个特定氨基酸替换的结果。ATP 绑定中的缺陷之一 (A184V) 紧邻沃克 A 框中 (P 循环母题) 原因 (卡尔和 Kaguni，1996 年，Mol 微生物 20： 1307年 1318年)。第二个氨基酸替代 (Y271H) 似乎稳定携带 A184V 替代突变体蛋白的活性。携带这两种氨基酸替换 (A184V + Y271H) 的突变蛋白质是有缺陷的奥里奇标记频率分析和复制总站附近的轨迹所示调节从奥里奇，启动的频率。这些结果表明 ATP 绑定中的缺陷会导致 DNA 复制的异常控制。
致病性大肠杆菌的 DnaA 蛋白质： 齐聚在大肠杆菌染色体起源是需要启动和涉及具体的 N-末端氨基酸。
复制启动器，DnaA 蛋白承认的迭代的 DnaA 框序列内的细菌和原核质粒复制起源。在大肠杆菌染色体原点，奥里奇，DnaA 被推测，oligomerize 以启动 DNA 的复制。我们制定了依靠自己处于非活动状态的两个 dnaA 基因互补的低聚物形成在奥里奇的测定。一个等位基因是 dnaA46 ；三磷酸腺苷结合具体缺陷而非许可的温度在其处于非活动状态。第二个等位基因，T435K，不因其不能绑定到 DnaA 框序列内奥里奇支持 DNA 复制。我们显示的 T435K 等位基因可以补充 dnaA46(Ts) 等位基因。结果支持低聚物形成的 DnaA 框序列的奥里奇都受的 DnaA46 的 T435K 然后绑定以形成积极的复杂的模型。依靠这种测定方法，亮氨酸 5、 6 色氨酸和半胱氨酸 9 中预测的阿尔法螺旋发现，当改变，会干扰低聚物形成。谷氨酰胺 8 另外需要奥里奇含粒，建议在染色体里奇轨迹的 DnaA 里奇复杂的结构类似，但不是等同于组装质粒上的低聚物形成。另有证据表明这 28 脯氨酸含量的 DnaA 参与 DnaB 招募到奥里奇。这些结果提供直接证据，齐聚在奥里奇是开始发生的必要条件的 DnaA。
Hyperinitiation 的 DNA 在大肠杆菌中复制会导致复制叉崩溃和 Inviability。
从高的质粒的高架的 dnaA 表达诱导更频繁地开始从奥里奇，大肠埃希氏大肠杆菌复制原点但保持活力。在比较中，染色体编码的 dnaAcos 也刺激启动，但这是致命。定量方法，我们显示的启动诱导高架的 dnaA 表达水平导致大多都在 10 地图单位的奥里奇的折叠的复制叉。因为叉随机，折叠核蛋白复合物在特定地点，如数据不是原因。当重新启动复制阻止突变的 recB 或 priA 时，通过高架的 dnaA 表达的增加的主动导致 inviability。折叠叉量下高架表达的 dnaAcos 的 dnaA 相比大幅提高。我们建议致命表型的染色体编码的 dnaAcos 是占压倒性优势的细胞修复能力的 hyperinitiation 的结果。
大肠埃希氏大肠杆菌大肠杆菌复制原点齐聚 DnaA 蛋白质功能基本 Tryptophan。
细菌 DNA 复制的起始，DnaA 蛋白招募 DnaB 解旋酶染色体的起源，奥里奇，导致在此站点复制叉机械的装配。因为 DnaA N 终点站附近的区域是必需的自我齐聚和 DnaB 解旋酶的加载在奥里奇，我们问是否这些函数是可分离或相互依存代许多保守的氨基酸丙氨酸确定基本残留与这一地区。我们展示 3 亮氨酸、 苯丙氨酸 46，和亮氨酸 62 丙氨酸替换不会影响 DnaA 函数中开始。相比之下，我们发现 DnaA 突变体的表征，色氨酸 6 至关重要的 DnaA 函数因为其替代由丙氨酸废除自齐聚，从而导致未能加载 DnaB 在奥里奇。这些结果表明 DnaA 绑定到奥里奇形式特定的寡聚结构，它需要加载 DnaB 解旋酶。
Y-家庭 DNA 聚合酶对 DNA 损伤无关抑制复制叉级数的作出反应。
在 Y 家庭 DNA 聚合酶 Pol 四 (DinB) 和 Pol V 大肠杆菌中 （UmuD2'C） 通过绕过禁止复制的 DNA 病变增强 DNA 损伤后的细胞存活。DNA 复制叉级数被捕不由外源 DNA 的损伤，但与脲 (胡)，从而抑制核苷酸还原酶和带来损害独立 DNA 复制失速时，我们报告这些异性简列独特功能。引人注目的是，umuC，dinB，和 umuD 基因产品的某些形式的 umuC122::Tn5 等位基因赋予大肠杆菌胡治疗 (珥) 的承受能力。都是 UmuC122 和 DinB 蛋白的催化性活动所需的户珥。此外，这种停滞不前的复制叉野生型衍生产品所带来的杀伤力似乎继续通过毒素/抗毒素对 mazEF 和 relBE。这种新型的功能显示 Y 家庭异性简列在提高细胞存活的核苷酸的饥饿，除了其既定职能中对 DNA 损伤反应条件下发挥作用。
需要对枯草芽孢杆菌 DNA 损伤的 RecA 本地化响应复制。
在原核生物和真核生物，参与 DNA 修复的蛋白经常组织到可以在活细胞中灶作为可视化的多元络合物。我们用 RecA GFP 融合来检查的直接 RecA-GFP 作为对 DNA 损伤反应疫源地组装的亚细胞线索。我们用两种不同的方法来抑制 DNA 复制的开始，并且确定 DNA 复制是需要的单元格后暴露于 DNA 破坏代理商建立 RecA GFP 疫源地。此外，使用的核酸内切酶裂解生成特定于站点的双链断裂表明复制机械 (replisome) 及 DNA 合成所需的 RecA GFP 疫源地的双链断裂修复过程中的程序集。我们监测的 RecA 细胞水平和发现重点形成不需要进一步诱导蛋白水平，这表明这一灶结果从现有蛋白重新分配到站点的损害所遇到的 replisome。两者合计，我们的研究结果支持模型，现有 RecA 蛋白招聘到生成的 DNA 损伤的地盘 replisome ssDNA。这些结果提供机制的深入该单元格使用招聘修复损坏 dna 在活细胞中的蛋白质。
多个 Ku Orthologues 调解 DNA 非同源结束-加入自由生活形式和期间的苜蓿中华根瘤菌的慢性感染。
细菌的非同源年底加入 （NHEJ） 仪器是两个组件系统，使用 Ku 和 LigD 来修复 DNA 双链断裂。虽然反应机制进行了广泛研究，太了解细菌 NHEJ 的生理作用。最近的研究表明 NHEJ 行为 DNA 复制在减少的条件下或缺席 （例如，在一个孢子或平稳阶段）。有趣的是，在各种各样的细菌，可以长期感染真核主机已 Ku 和 LigD 编码的基因。引人注目的是，Sinohizobium 苜蓿、 豆科植物细胞内共生进行编码 Ku 同系物的四个基因 （sku1 到 sku4）。删除 sku 基因分析表明所有 Ku 同系物功能。这些基因，sku2 中的一个强烈表示是自由生活的细胞，在驻留在主机厂的 bacteroid 单元格。若要可视化的 NHEJ 器具体内，到黄色荧光蛋白 (YFP) 融合 SKu2 蛋白。电离辐射 (IR) 以剂量依赖的方式诱导重点形成的 SKu2 YFP 自由生活的单元格中。此外，SKu2 YFP 灶形成非划分的抗，指示 NHEJ 系统功能性共生慢性感染阶段甚至在红外响应。
Beta 版夹在枯草杆菌中指示本地化的错配修复。
MutS 同源功能的几个细胞通路包括错配修复 (MMR)，其中介绍了 DNA 复制过程的不匹配时更正的过程。我们表现出的枯草芽孢杆菌 MutS C 终点站是必要的互动与 beta 夹。这种相互作用是必需的 MutS GFP 重点对形成的不匹配。反过来说，我们显示突变体的测试版夹导致高架的突变的频率，并减少了 MutS GFP 重点形成。互动与 beta 夹 MutS 突变体缺陷未能支持 MMR，锡试验 GFP 重点形成的下一步。我们得出的结论 MutS 与 β 之间的互动是促进重点形成的主要分子相互作用和该 beta 夹艾滋病在 MutS 稳定在体内不匹配。MutS C 总站的惊人能力在 replisomes 上的重点形成直接的本身，表明它是与试用版许可证 MutS 互动夹的不匹配识别。
中电和 Lon 蛋白酶职位不同亚细胞的枯草芽孢杆菌。
除其他职能外 ATP 依赖性蛋白酶降解纠缠的蛋白质和删除激活应激反应所需的几个关键调控蛋白。在芽孢杆菌枯草、 ClpX、 ClpE、 和 ClpC 形成 homohexameric 三 ClpP 肽酶对那对夫妻。若要了解在这些 peptidases 和三本地化在活细胞中，每个蛋白被烤瓷荧光的结构。我们发现 ClpX GFP (绿色荧光蛋白) 和 ClpP GFP 本地化作为重点程序集未被占领，nucleoid 的地区。我们发现与 ClpP GFP 病灶细胞的百分比增加后热休克蛋白合成独立。我们已确定 ClpE-YFP （黄色荧光蛋白） 和 ClpC YFP 形成疫源地与 nucleoid 边缘重合通常接近细胞两极。此外，我们发现 ClpQ YFP (HslV) 作为小病灶，本地化通常细胞膜附近的位置。我们发现 ClpQ YFP 灶依赖同源六 ATPase ClpY (HslU) 的存在。此外，我们发现现身后 GFP 期间正常增长是与 nucleoid 重合现身后 GFP 也本地化为 forespore 在开发过程中。我们还调查 LonB-绿色荧光蛋白，发现已本地化为 forespore 膜早在发展，这种蛋白质跟在后来的发展 forespore 整个本地化。我们的全面研究表明几个 ATP 燃蛋白酶枯草上占据不同的亚细胞位置。面对这些数据，我们建议底物专一性可以确定，部分由时空组织蛋白酶体内。
对大肠埃希氏大肠杆菌和枯草芽孢杆菌之间的双链断裂的答复比较显示 SOS 感应不同的要求。
DNA 双链断裂是特别有害的病变，会导致基因组不稳定性和细胞死亡。对大肠埃希氏大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的双链断裂的 SOS 反应，我们对此进行调查。在大肠杆菌、 电离辐射诱导的双链断裂导致 SOS 感应中几乎每个单元格。大肠杆菌菌株 SOS 感应能力是对电离辐射敏感。在鲜明的对比，我们发现枯草电离辐射和特定于站点的双链断裂原因只有小的细胞亚群前噬菌体 PBSX 和 SOS 基因表达的诱导。这些结果表明双链断裂引起全球 SOS 感应在大肠杆菌中但不是在枯草。引人注目的是，RecA GFP 重点形成了几乎相同的后电离辐射在大肠杆菌和 B.枯草，表明 RecA GFP 灶形成双链断裂响应发生但不需要或导致 SOS 感应在枯草中面临的挑战。此外，我们发现这枯草细胞诱导 SOS 了附近野生型水平的电离辐射响应生存的能力。此外，枯草 RecN 有助于维持低水平的 SOS 感应期间双链断裂修复。因此，我们发现的 SOS 感应到双链断裂修复贡献大大不同大肠杆菌、 枯草杆菌。
苜蓿中华根瘤菌 CpdR1 是统筹细胞周期进程和共生的慢性感染的关键。
ATP 驱动蛋白水解作用主要调节细菌细胞周期、 发展和应激反应。在硝基-苜蓿中华根瘤菌固定寄主植物共生，经历深刻的细胞分化，包括核分泌性中耳炎。S.planta 苜蓿细胞周期调控改建的规管机制是主要是未知的。在这里，我们报告的两个 cpdR 同系物、 cpdR1 和 cpdR2，试验单一域响应监管机构对其进行编码的表征。在 Caulobacter crescentus，CpdR 控制极地本地化的 ClpXP 蛋白酶，从而调解关键的 protein(s)，如 CtrA，参与细胞周期调节蛋白质分解。S.苜蓿 cpdR1 null 突变可以侵入宿主细胞质，不过，不能分化成抗胞内的细菌。我们展示 S.苜蓿 CpdR1 已极地本地化模式和 ClpX 定位中的作用类似于 C.crescentus CpdR，暗示守恒之间 alpha proteobacteria CpdR 蛋白质的功能。然而，在试验，cpdR1 null 突变体自由生活单元格显示惊人形态不规则的 coccoids 和异常 DNA 复制。因此，我们可以展示 CpdR1 介导的细胞周期事件，这是自由生活的细胞分裂和分化慢性胞内感染所需的关键协调工作。
羟基脲诱导在大肠杆菌中羟基自由基介导的细胞死亡。
羟基脲 (胡) 专门抑制一类核苷酸还原酶 （罗马尼亚），消耗 dNTP 池和导致复制叉逮捕。虽然胡抑制的罗马尼亚公认的其中它导致细胞死亡的机制依然不明。调查胡诱导细胞死亡的机制，我们用一种系统级方法来确定对胡治疗大肠杆菌的基因组和生理反应。我们的研究结果表明其中胡治疗迅速诱导一套管理基因组不稳定性的保护反应的模型。继续的胡应力激活铁吸收和毒素 MazF 和面临，其活动造成的不完全翻译蛋白质合成及信封应激反应的刺激。这些影响改变某个单元格的终端的细胞色素氧化酶，导致增加超生产中的属性。增加的超生产、 增加的铁的吸收，以及燃料贡献胡诱导细胞死亡的羟自由基的形成。
芽孢杆菌枯草 Beta 夹在单独的其角色不匹配从 DNA 复制过程中的突变修复。
Beta 夹是滑动夹葛 DNA 合成所需基本复制。Beta 夹也是关键的几个其他方面的 DNA 代谢，包括 DNA 错配修复 (MMR)。枯草芽孢杆菌 dnaN5 基因编码一种突变形式的 beta 夹含 G73R 替代。DnaN5 等位基因与细胞温度敏感的缺陷在 49 度 C、 DNA 复制而增长，它们表明，孕产妇死亡率在纵容温度下的部分缺陷引起的突变频率增加。我们选择了为救出活力在 49 度 C，以确定是否可以分离 DNA 复制缺陷的 dnaN5 的抑制从 MMR 缺陷。我们孤立还原在 nonpermissive 温度的增长，同时继续维持在突变频率的增加的 dnaN5 三个的抑制。所有三个 dnaN 等位基因编码 G73R 替换以及三个新错义突变之一。孤立的错义突变是 S22P、 S181G、 E346K。其中，S181G 和 E346K 位于疏水腭裂的 beta 版夹，被占领的绑定 beta 夹的蛋白质共同站点附近。我们使用的几种方法，显示产生的每个 dnaN 等位基因的突变频率的增加链接到孕产妇死亡率的缺陷。此外，我们发现 S181G 和 E346K 允许在温度升高的增长并没有明显的影响突变频率时分开 G73R。因此，我们发现枯草 beta 夹具体残留变化分隔 beta 钳从其孕产妇死亡率方面的作用的 DNA 复制过程中的作用。
锡试验的核酸内切酶域的结构： 无牌削减。
DNA 错配修复纠正逃脱了聚合酶校对、 增加复制保真 100-到 1000 倍从细菌到人类有机体中的错误。锡试验蛋白作用中央在错配修复通过协调多个信号后由 MutS 不匹配识别的钢绞线去除的蛋白质-蛋白质相互作用。在这里我们报告的枯草芽孢杆菌锡试验的核酸内切酶域的晶体结构。结构的组织中二聚和监管子域由跨越守恒核酸内切酶母题的螺旋杆连接。额外的保守的图案拉杆周围群集和定义一个 Zn(2+) 绑定站点，是锡试验函数体内的关键。结构推出了功能强大的抑制机制，以防止意外顺手牵羊的新复制的 DNA，并允许我们提议描述如何与 MutS 和 processivity 夹相互作用可以许可核酸内切酶活性的锡试验模型。结构还提供了建议和其他角色的锡试验测试中错配修复分子框架。
大肠埃希氏大肠杆菌 YbeY，高保守蛋白，在 RRNA 加工中的作用。
UPF0054 蛋白家族是高度守恒与同系物中几乎每个有序的细菌存在。在某些细菌，各自的基因是必不可少的同时在其他其损失会导致高度多效性表型。尽管详细结构的研究，为此蛋白家族细胞作用仍然未知。我们在这里报告指出，删除大肠埃希氏大肠杆菌同系物，YbeY，显著影响核糖体活动、 平移保真度和核糖体装配的缺陷的原因。映射的 16S、 23 型飞机和 5S rRNA 总站揭示了 YbeY 影响的所有三个 rRNAs，特别强的效果，对在这两个 5' 成熟与成熟的和 3' 端的 16S rRNA 以及成熟的 5'-总站的 23 型飞机和 5S rRNAs。此外，我们证明 ybeY 和 rnc (编码核糖核酸酶 III)、 ybeY 和罗马尼亚 （编码核糖核酸酶 R） 和 ybeY 和即插即用 （编码 PNPase） 强遗传相互作用，进一步 rRNA 成熟 YbeY 的暗示作用。突变的高保守氨基酸的 YbeY，允许两个残留 R59 H114），被发现，有很大的影响，体内的鉴定。我们为 rRNA 成熟和细菌核糖体大会讨论这些研究结果的影响。
DNA 损伤和活性氮物种是弧菌霍乱弧菌殖民化幼鼠肠道障碍。
霍乱弧菌摄取通过胃和小肠内其主机的殖民化。在这里，我们表明霍乱弧菌需要至少两种类型的 DNA 修复系统，以有效地争夺幼鼠小肠的殖民化。这些结果显示霍乱弧菌经验增加小鼠胃肠道中的 DNA 损伤。我们同意这项计划，显示小鼠肠道通过增加突变的频率相比，液体培养通道的霍乱弧菌。我们遗传分析确定所需的解毒也需要为霍乱弧菌高效地拓殖幼鼠小肠，指向活性氮物种的 DNA 损伤的潜在原因的活性氮物种 （但不是活性氧物种) 的已知和新型防御酶。我们表明潜在有害的霍乱弧菌的活性氮物种不生成的主机一氧化氮合酶 (iNOS) 活动，相反可能源自酸化亚硝酸盐，在胃中。我们同意这一假设，显示菌株 DNA 修复或活性氮物种防御有不足之处，但在肠道定植存在缺陷有下降增长或增加包含媒体的酸化亚硝酸盐突变频率。此外，我们证明中和胃酸营救殖民化的 DNA 修复缺陷和活性氮物种防御建议共同防卫这些突变菌株的缺陷突变体。
错配修复原因基本 DNA 聚合酶复制叉从动态释放。
错配修复 (MMR) 纠正 DNA 聚合酶基因组复制期间发生的错误。MMR 基因组维护至关重要，其损失增加突变率几个几百倍。最近的工作表明不匹配识别蛋白 MutS 和复制 processivity 夹之间的相互作用是重要的孕产妇死亡率在枯草芽孢杆菌。为进一步了解如何将 MMR 耦合到 DNA 复制，我们审查了融合在活细胞中的绿色荧光蛋白 (GFP) 的孕产妇死亡率和 DNA 复制蛋白的亚细胞定位后增加 DNA 复制错误。我们证明基本 DNA 聚合酶 DnaE GFP 灶减少之后不匹配将纳入和损失 DnaE GFP 灶需要 MutS。此外，我们显示 MutS 和锡试验绑定 DnaE 体外，暗示 DnaE 再加上修复。我们也发现这 DnaE GFP 灶减少体内显示 DnaE GFP 疫源地的损失造成的扰动到 DNA 复制的 DNA 合成 DNA 损伤独立拘捕。我们建议 MutS 直接接触的 DNA 复制机制，导致 DnaE MMR 期间在复制叉的组织中的动态变化。我们的结果建立引人注目和亲密 MMR 与体内复制的 DNA 聚合酶复合之间的连接。
