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- Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus
- Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile
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Articles by Brandon E. Johnson in JoVE
JoVE General
Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.
JoVE General
Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Questo video mostra come utilizzare un estrattore programmabile per rendere pipette cerotto e gli elettrodi taglienti per elettrofisiologia. La stessa procedura può essere usato per fare una varietà di strumenti in vetro, tra cui aghi da iniezione.
Other articles by Brandon E. Johnson on PubMed
Alfa-sinucleina Germogliare Lievito Modello: Tossicità Rafforzata Da Compromissione Del Proteasoma E Stress Ossidativo
Malattia di Parkinson (MdP) è una comune malattia neurodegenerativa che provoca la perdita selettiva di Neuroni dopaminergici mesencefalo. Misfolding e aggregazione della proteina alfa-sinucleina, danno ossidativo e svalutazione proteosomale sono tutte le ipotesi per la causa molecolare di questa neurotossicità selettiva. Qui, descriviamo un modello di Saccharomyces cerevisiae per valutare il misfolding, aggregazione, e capacità di indurre tossicità del selvaggio-tipo alfa-sinucleina e tre mutanti (A30P, A53T e A30P/A53T) e ci confronta regolamento di queste proprietà dai proteasomi disfunzionali e dallo stress ossidativo. Abbiamo trovato localizzazione prominente di wild-type e A53T alfa-sinucleina nei pressi della membrana del plasma, in vitro lipido-associazione conosciuta capacità di supporto. Al contrario, A30P principalmente era citoplasmatico, mentre A30P/A53T visualizzati entrambi i tipi di fluorescenza. Sorprendentemente, alfa-sinucleina non era tossico per i diversi ceppi di lievito testati. Sono stati osservati quando mutanti di lievito per la canna proteosomale (doa3-1) sono stati valutati, ritardato alfa-sinucleina sintesi e membrana dell'associazione; mutante di lievito per la PAC proteosomale (sen3-1) esposto aumentato accumulo e l'aggregazione di alfa-sinucleina. Entrambi sen3-1 e 1 doa3 mutanti esposto letalità sintetica con alfa-sinucleina. Quando i lieviti sono stati sfidati con un ossidante (acqua ossigenata), alfa-sinucleina era estremamente letale per le cellule che mancavano al manganese superossido dismutasi manganese-SOD (sod2Delta), ma non alle cellule che mancavano di rame, zinco superossido dismutasi Cu, Zn-SOD (sod1Delta). Nonostante la tossicità, le cellule sod2Delta mai visualizzato aggregati intracellulari di alfa-sinucleina. Suggeriamo che la specie tossica alfa-sinucleina in lievito sono più piccoli di aggregati visibili e tossicità potrebbe coinvolgere associazione membrana alfa-sinucleina. Così, lieviti sono emersi gli organismi efficaci per caratterizzare i fattori e i meccanismi che regolano la alfa-sinucleina tossicità.
Il Tracker Worm Parallele: Una Piattaforma Per La Misurazione Della Velocità Media E La Paralisi Indotta Da Farmaci Nei Nematodi
Caenorhabditis elegans locomozione è un comportamento semplice che è stato ampiamente utilizzato per sezionare componenti genetiche del comportamento, Trasmissione sinaptica e la funzione muscolare. Molti dei paradigmi che sono stati creati per lo studio di c. elegans locomozione si basano sull'osservazione qualitativa sperimentatore. Qui riportiamo l'implementazione di un sistema di rilevamento automatizzato sviluppato per quantificare la locomozione di vermi più singoli in parallelo.
Il Complesso Distrofina Controlla Bk Canale Attività Muscolare E La Localizzazione in Caenorhabditis Elegans
Difetti genetici della distrofina-associati proteina complessa (DAPC) sono responsabili di una varietà di condizioni patologiche, tra cui la distrofia muscolare, cardiomiopatia e vasospasmo. Componenti DAPC conservati dagli esseri umani a Caenorhabditis elegans suggeriscono una simile funzione molecolare. C. elegans mutanti DAPC esibiscono un deficit motorio unico derivante dalla contrazione ed eccitazione muscolare prolungata. Qui vi mostriamo che la c. elegans DAPC è essenziale per la corretta localizzazione di SLO-1, il grande conduttanza, tensione e canale del potassio calcio-dipendente (BK), che conduce un'importante corrente rettifica esternamente nel muscolo sotto la condizione fisiologica normale. Attraverso l'analisi di mutanti con lo stesso fenotipo come i mutanti DAPC, abbiamo identificato il romanzo islo-1 gene che codifica per una proteina con due domini transmembrana predetti. Dimostriamo che ISLO-1 agisce come molecola adattatore romanzo che collega il DAPC di SLO-1 nel muscolo. Dimostriamo che un difetto nella DAPC o ISLO-1 sconvolge la normale localizzazione SLO-1 nel muscolo. Coerente con le osservazioni che SLO-1 richiede una concentrazione elevata di calcio per l'attivazione completa, troviamo che SLO-1 è localizzato vicino a canali calcio tipo L nel muscolo, fornendo in tal modo un meccanismo di accoppiamento afflusso di calcio con la rettifica esterno corrente. I nostri risultati indicano che il DAPC modula eccitabilità muscolare localizzando il canale SLO-1 nelle regioni ricche di calcio del muscolo di c. elegans.
In Alternativa Impiombati Domini Interagiscono Per Regolare Il Canale Di Potassio BK Gating
Geni più umani contengono più siti di splicing alternativo creduti per estendere la complessità e la diversità del proteoma. Tuttavia, poco è conosciuto circa come le interazioni tra gli esoni alternativi regolano la funzione della proteina. Abbiamo usato il Caenorhabditis elegans slo-1 grande calcio di conduttanza e gene del canale del potassio voltaggio-attivati (BK), che contiene tre alternativa splice siti (A, B e C) e codifica splice almeno 12 varianti, per indagare le conseguenze funzionali di splicing alternativo. Questi splice siti abilitare l'inserimento degli esoni, codifica parte del regolatore di conduttanza K(+) (RCK) 1 Ca(2+) coordinamento dominio (esoni A1 e A2) e porzioni di linker RCK1-RCK2 (esoni B0, B1, B2, C0 e C1). Esoni A1 e A2 sono utilizzati in modo reciprocamente esclusivo e sono identici al 67%. Gli altri esoni possono estendere il linker RCK1-RCK2 fino a 41 residui. Registrazioni elettrofisiologiche di tutte le isoforme mostrano che gli esoni A1 e A2 regolano attivazione cinetica e Ca(2+) sensibilità, ma solo se gli esoni alternativi sono inseriti nel sito B o C. Così, RCK1 interagisce con il linker RCK1-RCK2, e l'effetto della variazione esone gating dipende dalla combinazione di esoni alternativi presenti in ciascuna isoforma.
Intragenic Alternative Splicing Coordinamento è Essenziale Per La Funzione Di Slo-1 Gene Caenorhabditis Elegans
Splicing alternativo è fondamentale per diversificare ai proteomi eucariotici, ma le norme che disciplinano e coordinare eventi tra più siti di splicing alternativo all'interno di singoli geni di splicing non sono ben comprese. Abbiamo sviluppato una strategia basata su PCR quantitativa per quantificare l'espressione di 12 trascrizioni codificata dal gene slo-1 Caenorhabditis elegans, contenente tre siti di splicing alternativo. Utilizzo dei modelli di probabilità condizionata, mostriamo che gli eventi di splicing sono coordinati attraverso questi siti. Ulteriormente, ci identifichiamo una mutazione puntiforme in un introne adiacenti al sito di uno splicing alternativo che sconvolge splicing alternativi a tutti i tre siti. Questa mutazione porta alla trasmissione sinaptica aberrante alla giunzione neuromuscolare. In un sondaggio di genomic, abbiamo trovato che un elemento UAAAUC interrotto da questa mutazione è arricchito in introni che fiancheggiano alternativi esoni nei geni con più siti di splicing alternativo. Questi risultati stabiliscono che adeguato coordinamento di splicing alternativo intragenic è essenziale per la normale fisiologia di slo-1 in vivo e identificare putativi elementi cis-regolatori specializzati che regolano la coordinazione di splicing alternativo intragenic.
