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Articles by Geoff Mealing in JoVE
JoVE Neuroscience
La culture et l'électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips
1Institute for Microstructural Sciences, National Research Council of Canada, 2Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canada, 3Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary
Nous montrons comment plane de patch-clamp puces fabriquées au sein du Conseil national de recherches du Canada sont stérilisés, apprêté, chargé avec le milieu, plaqué avec des cellules, et utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques.
Other articles by Geoff Mealing on PubMed
Protection Des Neurones Corticaux Contre L'oxygène-glucose Privation Et La N-méthyl-D-aspartate Par DIDS Et SITS
Le Cl (-) de blocage des canaux, le 4,4 '-diisothiocyanatostilbene-2, 2'-disulfonique (DIDS) ou 4-acétamido-4'-isothiocyanatostilbene-2, 2'-disulfonique (SITS) dépendante de la dose protégés contre la privation d'oxygène-glucose dans les neurones corticaux de rat en culture. DIDS ou assis atténués oxygène-glucose induits par la privation des augmentations des concentrations de glutamate extracellulaire et intracellulaire de Ca (2 +). DIDS ou assis fourni une protection modérée contre la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et la toxicité a diminué NMDA médiés par les récepteurs des augmentations de la concentration intracellulaire de Ca (2 +). Cellules entières courants des récepteurs NMDA ont été atténuées 39 + / -2% et 21 + / -3% en 1 mM DIDS et SITS, respectivement. Cl Autres (-) que les bloqueurs des canaux équipotent que DIDS et siège ne diminue pas la privation d'oxygène-glucose ou le NMDA médiation neuronale Ca (2 +) afflux ou de toxicité. Neurotoxicité par le glutamate exogène n'a pas été empêché par SITS et a été exacerbée par DIDS. Les réductions de l'oxygène-glucose privation provoqués par l'augmentation des concentration intracellulaire de Ca (2 +) sous-tendent les niveaux neuroprotection par DIDS et SITS. Il s'agissait d'un reflet de la faible extracellulaire [glutamate], l'inhibition directe de Ca (2 +) l'influx par les récepteurs NMDA postsynaptiques, et éventuellement par d'autres propriétés de protection liés à DIDS et s'assoit.
Protection Par Le Cholestérol-extractibles Cyclodextrines: Un Rôle Pour La Redistribution Des Récepteurs N-méthyl-D-aspartate
Cyclodextrines (CD) sont des oligosaccharides cycliques composés d'une cavité centrale lipophile et une surface externe hydrophile. Certains CD sont capables d'extraire le cholestérol des membranes cellulaires et peuvent affecter la fonction des récepteurs et des protéines localisées dans des domaines membranaires riches en cholestérol. Dans ce rapport, nous démontrons l'activité neuroprotectrice de certains dérivés de CD contre la privation d'oxygène-glucose (OGD), N-méthyl-D-aspartique (NMDA) et de glutamate dans les cultures de neurones corticaux. Bien que tous les CD complexé avec NMDA ou le glutamate, que le bêta-, bêta-méthylé et sulfaté bêta-CD activité déployée neuroprotecteur et abaissé le taux de cholestérol cellulaire. Seuls les CD qui ont fait baisser le taux de cholestérol redistribué la sous-unité du récepteur NMDA NR2B, PSD-95 (protéine de la densité post-synaptique 95 kDa) et l'oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) de Triton X-100 domaines membranaires insolubles aux fractions solubles. Réplétion Cholestérol contrecarré la capacité de brûler bêta-CD pour protéger contre la toxicité du NMDA, et a infirmé NR2B, PSD-95 et la localisation de la nNOS Triton X-100 fraction membranaire insoluble. Étonnamment, CD neuroprotecteurs eu un effet minime sur les NMDA médiés par les récepteurs des augmentations de la concentration intracellulaire de Ca (2 +) de concentration ([Ca (2 +)] (i)), mais ne suppriment OGD-induites des augmentations de [Ca (2 +)] ( i). bêta-CD, mais pas Mbeta-CD, a également causé un bloc léger de NMDA-courants induits, ce qui suggère une contribution mineure à la neuroprotection par l'action directe sur les récepteurs NMDA. Pris dans leur ensemble, les données suggèrent que l'extraction du cholestérol à partir de détergent-résistantes microdomaines affecte la distribution sous-unité NMDA récepteurs et de propagation du signal, ce qui entraîne dans la neuroprotection des cultures de neurones corticaux contre les insultes et ischémiques excitotoxique. Depuis domaines membranaires riches en cholestérol existent dans neuronales densités post-synaptiques, ces résultats impliquent que les sous-populations de récepteurs NMDA synaptiques sous-tendent l'excitotoxicité, qui peuvent être ciblés par des CD sans affecter l'ensemble des neurones Ca (2 +) les niveaux.
Une Alternative Ca2 +-dépendante Mécanisme De Neuroprotection Par La Classe De Métalloporphyrine Mimétiques Superoxyde Dismutase
Cette étude remet en question l'opinion traditionnelle selon laquelle métalloporphyrines protéger des cultures de neurones corticaux dans les modèles d'ischémie cérébrale en agissant comme intracellulaire [superoxyde dismutase (SOD) mimétiques] antioxydants catalytique. Haute-SOD actifs Mn (III) porphyrines méso-substituée avec la N, N'-diméthyl ou N-alkylpyridinium groupes n'ont pas de protéger les neurones contre la privation d'oxygène-glucose (OGD), bien que plus faible SOD-active et inactive par isomères protégé contre N -méthyl-D-aspartate (NMDA) l'exposition. Mn (III) méso-tétrakis (4-benzoïque) porphyrine (Mn (III) PETM), ainsi que la SOD-inactifs et l'autre metalloTBAPs anneaux ou phényle métalloporphyrines bêta-substitués qui contiennent redox-insensibles métaux, des cultures protégées contre AM et la neurotoxicité du NMDA. Fondamentalement, métalloporphyrines neuroprotecteurs supprimé hausses des autres ministères ou induite par le NMDA dans Ca2 + intracellulaire de concentration dans le classement général même que celle observée pour la neuroprotection. Résultats de la toxicité du paraquat, intracellulaire extinction de la fluorescence, l'électrophysiologie, mitochondrial Ca2 +, et spontanées expériences activité synaptique suggèrent un modèle dans lequel métalloporphyrines, agissant à la membrane plasmique, de protéger les neurones contre les OGD en supprimant postsynaptiques NMDA médiés par les récepteurs de Ca2 + augmente, par conséquent, indirectement prévention de l'accumulation des neurotoxiques mitochondriales Ca2 + niveaux. Bien que neuroprotecteur d'une manière non prévu à l'origine, la SOD-inactifs métalloporphyrines peut représenter prometteurs agents thérapeutiques dans les maladies telles que l'ischémie cérébrale, dans laquelle Ca2 + toxicité est impliquée. Synthèses classiques visant à améliorer la capacité antioxydante de catalyseur et / ou l'accès intracellulaire de métalloporphyrines peut ne pas donner une meilleure efficacité dans certains modèles de la maladie.
Chlortétracycline Et Demeclocycline Inhibition Calpaïnes Et De Protéger Les Neurones De Souris Contre La Toxicité Du Glutamate Et L'ischémie Cérébrale
La minocycline est un puissant neuroprotecteur tétracycline dans des modèles animaux d'ischémie cérébrale. Nous avons examiné les propriétés protectrices de la chlortétracycline (CTC) et la déméclocycline (DMC) et a montré que ces deux tétracyclines sont également de puissants neuroprotecteurs contre glutamate mort neuronale induite par in vitro et in vivo d'ischémie cérébrale. Toutefois, CTC et la DMC semble conférer une neuroprotection grâce à un mécanisme unique par rapport à la minocycline. Plutôt que de l'activation microgliale inhiber et de la caspase, CTC et la DMC supprimé activités calpaïne. En outre, CTC et la DMC que faiblement antagoniste du N-méthyl-D-aspartate (NMDA) des activités des récepteurs provoquant 16 et 14%, respectivement, l'inhibition des récepteurs NMDA courants induits par des cellules entières et partiellement bloqué induite par le NMDA Ca2 afflux +, communément considéré comme le déclencheur majeur de la mort neuronale. In vitro et in vivo ont démontré que les deux composés inhiber sélectivement les activités de la calpaïne I et II activé suite à un traitement glutamate et l'ischémie cérébrale. En revanche, la minocycline n'a pas significativement inhiber l'activité de la calpaïne. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que CTC et la DMC fournir une neuroprotection par la suppression d'une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2 + et l'inhibition des calpaïnes.
Neurogenèse Et De La Communication Neuronale Sur Neuropuces Microélectrodes
Les réseaux de neurones sont formés par la connectivité précise de neurones et cellules gliales dans le cerveau. Ces réseaux emploient un modèle tridimensionnel de la surface bio que les deux attribue des coordonnées précises aux cellules pendant le développement et facilite leur connectivité et les fonctionnalités tout au long de la vie. Utilisation de fonctions spécifiques topographiques et chimiques, nous avons pris des mesures pour le développement de la poly (diméthylsiloxane; PDMS) neuropuces qui peuvent être utilisés pour générer et d'étudier les réseaux de neurones de synthèse. Ces neuropuces ont microélectrodes des structures qui permettent le positionnement adéquate des cellules et la survie cellulaire soutien. Quelques jours plus tard de placage, les cellules se différencient en neurones présentant l'excitabilité et de la communication, comme en témoignent les oscillations de calcium intracellulaire et le potentiel d'action. Les capacités structurelles et fonctionnelles de ces simples réseaux neuronaux ouvrir de nouvelles perspectives pour étudier la communication et la plasticité synaptique.
Approches Concurrentes à La Neuroprotection Excitotoxique Par Porphyrines Antioxydants Inertes Et Catalytique
L'objectif de cette étude était de déterminer si de nouvelles porphyrines protéger des cultures de neurones corticaux de l'exposition NMDA excitotoxique ou de l'oxygène-glucose privation (OGD), le modèle des aspects clés de l'ischémie cérébrale. Les porphyrines ont été choisis en fonction de critères classiques et non classiques. Métalloporphyrine catalytique antioxydants possédant un noyau métallique redox-sensibles peuvent présenter des puissants et de grande envergure capacités antioxydantes catalytiques, qui sont classiquement être à l'origine de neuroprotection. Nous rapportons ici que d'une récente génération puissant catalyseur de décomposition du peroxynitrite, FP-15, à l'abri la majorité des neurones contre la toxicité des autres ministères et NMDA, sans supprimer le NMDA médiation intracellulaire de Ca2 + (CaI2 +) élévations ou des cellules entières courants. Nous avons précédemment montré que la neuroprotection contre la toxicité des autres ministères et NMDA corrélée avec une capacité de supprimer neurotoxiques CaI2 + de élévations et non sur la capacité antioxydante. Nous avons maintenant d'évaluer si ce mécanisme non conventionnel s'étend à inertes sans métal porphyrines. Des cultures de neurones ont été complètement protégés contre les autres ministères et NMDA toxicité par H2-méso-tétrakis (3-benzoïque) porphyrine (H2-PETM (3)) ou H2-méso-tétrakis (4-sulfonatophényl) porphyrine (H2-TPPS (4) ), bien que seulement H2-PPT (4) supprimées (complètement) induites par le NMDA CaI2 + de hausse. H2-méso-tétrakis (3,3 '-benzoïque) porphyrine (H2-PETM (3,3')) ou H2-méso-tétrakis (N-methylpyridynium-4-yl) porphyrine (H2-TM-PvP (4 )) à condition qu'au moins une protection partielle contre les autres ministères et la toxicité du NMDA et partiellement supprimé induites par le NMDA CaI2 + de élévations. Malgré la complexité de Ca2 +-indépendante et qui dépendent des mécanismes basés sur l'inventaire des porphyrines démontrant la neuroprotection dans l'ischémie-pertinentes insultes est maintenant élargi pour inclure FP-15 et inertes sans métal composés, mais avec aucun avantage apparent acquise par utilisation de la PF-15 .
Dans Les études in Vitro De La Glycoprotéine Antigel (AFGP) Et Un C-liée AFGP Analogique
Glycoprotéines antigel (protéines antigel) sont une sous-classe des antigels biologiques présents dans les poissons de la mer profonde Teleost. Ces composés ont la capacité de faire baisser le point de congélation de l'organisme tel qu'il peut survivre aux températures inférieures à zéro rencontrées dans son environnement. Cette propriété physique est très attrayant pour la cryoconservation des cellules, tissus et organes. Récemment, notre laboratoire a conçu et synthétisé une fonctionnelle de carbone lié à (C-linked) AFGP analogique (1) qui démontre une énorme promesse comme un cryoprotecteur roman. Ici, nous décrivons les effets in vitro et les interactions de C-liée analogique AFGP 1 et natif AFGP 8. Nos études révèlent que AFGP 8 est cytotoxique pour le foie embryonnaire humain et cellules rénales embryonnaires humaines à des concentrations supérieures à 2 et 0,63 mg / mL, respectivement, tandis que des concentrations plus faibles ne sont pas toxiques. Le mécanisme de cette cytotoxicité est compatible avec l'apoptose, car la caspase-3/7 niveaux sont significativement plus élevés dans des cultures cellulaires traités avec AFGP 8. En revanche, C-liée AFGP analogique 1 ne présentait aucun cytotoxicité in vitro, même à des concentrations élevées, et notamment, la caspase-3/7 activités ont été supprimées bien en dessous des niveaux de fond dans les lignées cellulaires traités avec 1. Bien que les résultats de ces études limitent les applications humaines de AFGP natif, ils illustrent les avantages de l'élaboration fonctionnels C-linked analogues AFGP pour diverses applications médicales, commerciales et industrielles.
Placement De Cellules Et De L'orientation Sur Des Substrats Pour Les Interfaces Neuropuces
Dispositifs d'interface tels que planaires intégrés de patch-clamp puces sont développées pour étudier l'activité électrophysiologique des réseaux neuronaux cultivés in vitro. L'utilité de ces dispositifs sera tributaire de la capacité d'aligner les neurones avec des fonctionnalités de l'interface sur la puce en contrôlant le placement neuronale et en guidant la connectivité cellulaire. Dans cet article, nous présentons une stratégie pour atteindre cet objectif. Patterned modification chimique des surfaces SiN avec des poly-D-lysine transférés de timbres PDMS a été utilisé pour favoriser l'adhérence et l'orientation de la cryo-conservés neurones corticaux primaires de rat. Nous démontrons que ces neurones peuvent être positionnés et grandi au fil caractéristiques microtrou qui finira par servir de patch-clamp interfaces sur la puce.
Une Silicon Novel Patch-clamp Chip Permis Haute Fidélité D'enregistrement De L'activité De Canaux Ioniques Fonctionnellement Neurones Définies
Nous rapportons un procédé de fabrication simple et à rendement élevé pour de silicium planes de patch-clamp puces, qui permettent une faible capacité et la résistance série de identifiés individuellement des neurones en culture. Ouvertures sont gravés dans un film de haute qualité de nitrure de silicium sur une plaquette de silicium; puits sont ouverts sur la face arrière de la plaquette par gravure humide et passivé par un film épais de dioxyde de silicium déposé à réduire la capacité de la puce et pour faciliter la formation d' une cellule à haute impédance d'étanchéité d'ouverture. La surface de puce est adapté pour la culture de plus de neurones un petit orifice dans le substrat avec un minimum de courant de fuite. Collectivement, ces fonctionnalités permettent de haute fidélité de l'enregistrement électrophysiologique des courants transmembranaires résultant de l'activité des canaux ioniques dans les neurones en culture. En utilisant des cultures de neurones Lymnaea nous faisons preuve de cellules entières enregistrements actuels obtenus à partir d'un protocole de stimulation voltage-clamp, et en courant en mode pince nous rapportons des potentiels d'action stimulées par étapes dépolarisation de la membrane. Malgré la taille relativement importante de ces neurones, un bon contrôle temporelle et spatiale de la tension membrane cellulaire était évident. A notre connaissance c'est le premier rapport de l'enregistrement de l'activité des canaux ioniques et des potentiels d'action de neurones cultivés directement sur un plan de patch-clamp puce. Cette plate-forme d'interrogation a un potentiel énorme en tant que nouvel outil à fournir rapidement des informations à haute teneur en cours de tests pharmaceutiques pour enquêter sur des modèles in vitro de la maladie, ainsi que la physiologie neuronale et la plasticité synaptique.
Haute-fidélité De Patch-clamp Enregistrements De Neurones En Culture Sur Un Microchip Polymer
Nous présentons une puce polymère capable de suivre l'activité neuronale avec une fidélité jamais obtenu sur un plan de patch-clamp appareil. Cardio-respiratoires neurones pédale de gauche dorsale 1 (LPeD1) à partir de Lymnaea mollusques ont été cultivées sur la surface de la micropuce polyimide pour 2 à 4 heures. Neurones mis en culture formée joints à haute résistance (gigaseals) entre la membrane cellulaire et la surface entourant les ouvertures gravées dans le polyimide. La formation a été observée Gigaseal sans appliquer une force externe, telle que aspiration, sur les neurones. La formation d'gigaseals, ainsi que la résistance d'accès faible et des valeurs de capacité de shunt de la puce de polymère entraîné enregistrements haute fidélité. Sur la puce de la culture de neurones a permis, pour la première fois sur un polymère de patch-clamp dispositif, l'enregistrement des potentiels d'action de haute fidélité physiologiques. Microfabrication du poly hybride (diméthylsiloxane)-polyimide (PI-PDMS) micropuce est examiné, comprenant une technique à deux couches PDMS de traitement résultant en minimisant les variations rétrécissement.
Une Enquête Mécanobiologique Des Plaquettes
Comprendre les voies mécanotransduction menant à la thrombose, il faudra des mesures progressives, y compris la détermination du comportement mécanique de la membrane des plaquettes en réponse aux charges appliquées. La capacité de déformation membrane plaquettaire, quantifiée par la progression membrane dans une micropipette verre de borosilicate de diamètre intérieur défini, est sondée dans les plaquettes murins en utilisant une gamme contrôlée de la pression négative (0-7 cm H (2) O). Sur la base de nos observations que la partie des plaquettes en dehors de la micropipette était la plupart du temps sphérique et que le volume des plaquettes n'a pas changé de l'aspiration, un continuum roman mécanique basé sur le modèle de l'expérience aspiration par micropipette plaquettaire a été créé, et un nouveau modèle hyperélastique matériau isotrope, y compris la membrane tension résiduelle a été proposé pour la membrane des plaquettes. Murins membranes plaquettaires maintenu un comportement à la déformation linéaire moyenne: L (p) / R (p) = 146 100 p (i) × R (p) + 19.923, où L (p) est la longueur des plaquettes aspiré dans la micropipette (m), R (p) est le rayon micropipette (m) et p (i) est la pression d'aspiration (Pa). Le modèle théorique a été utilisé pour générer les constantes du matériau pour la membrane des plaquettes murin qui a permis pour une simulation précise des expériences aspiration par micropipette. A partir des résultats publiés, une autre série de constantes du matériau a été établi pour la membrane des plaquettes humain. Nombre limité de cas de lyse plaquettaire de l'aspiration ont été analysées en utilisant le modèle théorique pour déterminer les valeurs préliminaires membrane de tension de résistance.
