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Articles by John H. Horne in JoVE
JoVE Neuroscience
Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish
1Department of Biology, Pace University, 2Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Division of Cell Biology and Cell Physiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology
La risoluzione temporale e spaziale di manipolazioni genetiche determina lo spettro di fenomeni biologici che possono turbare. Qui usiamo temporalmente e spazialmente discreto
Other articles by John H. Horne on PubMed
Integrazione Dei Segnali Di Calcio Da Calmodulina Nei Neuroni Sensoriali Di Ratto
Abbiamo usato la calmodulina fluorescente coniugato TA-CaM per seguire attivazione calmodulina durante la depolarizzazione dei neuroni sensoriali di ratto adulto. Concentrazione di calcio è stata misurata simultaneamente utilizzando l'indicatore di bassa affinità Oregon Green BAPTA 5N. Fluorescenza TA-CaM aumentato durante una depolarizzazione di 200 ms, ma poi ha continuato ad aumentare durante i successivi 500 ms, anche se il calcio totale di cellule stava cadendo in questo momento. Entro pochi secondi fluorescenza TA-CaM è caduto, ma a un nuovo elevato livello che è stato poi mantenuto per diverse decine di secondi. Durante un treno di depolarizations che evoca una serie di modifiche in gran parte indipendenti calcio fluorescenza TA-CaM è stata sollevata in contrasto per tutta la durata del treno e per molte decine di secondi dopo. La presenza di un peptide corrispondente al dominio calmodulin binding della chinasi della catena leggera della miosina significativamente aumentato l'aumento di fluorescenza indotta depolarizzazione TA-CaM e rallentato la successiva caduta di fluorescenza. Interpretiamo il componente lenta ripresa del segnale TA-CaM come riflettendo la lenta dissociazione del calcio - calmodulina - complessi di proteina calmodulin binding. I nostri risultati mostrano che, dopo l'interazione di attività elettrica breve calmodulina con calmodulina proteine di legame persistono per circa un minuto.
La Risoluzione Temporale Di Elettroporazione in Vivo in Zebrafish: Un Metodo Per La Perdita Della Funzione Time-resolved
Un avvertimento agli attuali approcci perdita di funzione nello zebrafish è che essi in genere disturbare funzione del gene dall'inizio dello sviluppo. Questo può essere problematico quando si tenta di studiare dopo gli eventi dello sviluppo. Elettroporazione in vivo è un metodo che ha dimostrato di essere efficace a integrare i reagenti nella sviluppo del sistema nervoso a più fasi più tardi dello sviluppo. Le caratteristiche temporali e spaziali di elettroporazione in vivo che sono state dimostrate in precedenza suggeriscono che questo potrebbe essere un approccio potente per l'analisi di perdita di funzione time-resolved. Qui, nel tentativo di dimostrare l'efficacia di questo approccio per l'analisi di un calendario specifico dello sviluppo - che di sviluppo iniziale del sistema visivo Danio rerio-abbiamo fatto una caratterizzazione sistematica dell'efficienza della elettroporazione in vivo in zebrafish attraverso più fasi di sviluppo, da 24 a postfertilization 96 h. Mostriamo che elettroporazione è efficiente nel fornire plasmidi di espressione a un gran numero di neuroni in più passaggi dello sviluppo, tra cui 24, 48 o postfertilization 96 h. Espressione da electroporated plasmidi è massima entro 24 h, e utile e significativa espressione è visto entro 6 h. elettroporazione può essere utilizzato per trasportare due plasmidi espressione separata (proteina fluorescente verde e mCherry), con conseguente coexpression nel 97% delle cellule. Soprattutto, elettroporazione può essere utilizzato per incorporare i reagenti siRNA, con conseguente atterramento 84% di una proteina dell'obiettivo (green fluorescent protein). In conclusione, elettroporazione in vivo è un metodo efficace per la consegna sia espressione basata su DNA plasmidi e reagenti di perdita di funzione basata su interferenza RNA ed esibisce le caratteristiche appropriate per essere utile come un approccio genetico time-resolved per indagare i meccanismi molecolari di sviluppo del sistema visivo.
Il Danio Rerio Optic Tectum Usando Elettroporazione in Vivo Di Targeting
Introduzione: elettroporazione In vivo è un metodo per la consegna di plasmidi e altri reagenti del oligonucleotide che offre un controllo temporale preciso. In zebrafish, elettroporazione in vivo è particolarmente adatto a fornire i vettori di espressione della proteina fluorescente verde (GFP) di sviluppo del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive una modifica di elettroporazione in vivo che può essere utilizzati per indirizzare specificamente la tectum ottica lo sviluppo degli embrioni di zebrafish cominciando a post-fertilization h 24 (hpf). Gli elettrodi di elettroporazione richiesti per questo approccio possono essere facilmente costruiti da materiali relativamente poco costosi. Microiniezione del DNA del plasmide al ventricolo mesencefalo seguito da un posizionamento preciso degli elettrodi elettroporazione permette per il targeting di sviluppare neuroni in un solo emisfero dell'ottica tectum. Utilizzando questo protocollo, il tectum ottica può essere efficacemente mirati in un'alta percentuale (79%) di esprimere gli embrioni. Questo metodo può essere utilizzato anche per fornire simultaneamente i vettori di espressione e perdita di funzione reagenti, che possono fornire un controllo temporale preciso di atterramento di funzione del gene.
