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Articles by Linda Lefievre in JoVE
JoVE General
이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2School of Medicine, University of Birmingham, 3Centre for Human Reproductive Science, Birmingham Women’s Hospital
자극 - evoked [칼슘
Other articles by Linda Lefievre on PubMed
파도 조개 Oocytes 의향 체포에서 출시에 따라 캠프의 증가
파도 조개 (Spisula solidissima) oocytes를 내가 무대 의향에 양산 meiosis의 그리고 그들은 남아 체포이 단계에서 수정까지. 전체 oocyte meiosis reinitiation, 먼저 germinal 기 쇠 약 (GVBD)에 의해 입증 높은 K(+) 또는 세로토닌 등 정자를 흉내 낸 인공 활성 제에 의해 유발 될 수 있습니다. 이전 보고서 표시 트리 트 먼 트의 oocyte 캠프 저해 정자 또는 세로토닌-유도, 하지만 하지 KCl 유발, 수준을 높일 생각 조개 oocytes에서 GVBD. 보기 같은 드롭은 동물의 왕국에 걸쳐 보편적으로 중요 한 양서류 나 불가사리 oocytes 및 지원, 이러한 관측 확장 oocyte에 하락에 대 한 잘 알려진 요구 포유류 캠프 수준. 우리 조개 oocytes에서 GVBD의 캠프 종속성을 다시 하 고 그 oocyte 캠프 수치를 높이 다양 한 트리 트 먼 트, 놀랍게도, 미치지 않 았 어 어느 KCl 또는 세로토닌-유도 GVBD 발견. 그러나 이러한 치료는 oocytes, 수정 시 GVBD을 저해 하지만 이것은 퓨즈/침투 oocytes; 정자의 실패 때문이 따라서, oocyte 활성화 등의 저해 아니었다. Oocyte의 직접 측정 세로토닌에 의해 활성화 후 레벨 캠프, KCl 또는 정자, 기대, 반대는 GVBD 전에 캠프 레벨 상승을 보였다. SQ22536, adenylyl cyclase 억제제를 사용 하 여 oocyte 캠프 레벨의 증가 부분적으로 방해와 GVBD 진행 하지만 중요 한 지체와 GVBD을 용이 일반 캠프 상승를 나타내는. 우리의 작업 MPF의 활성화로 이어지는 업스트림 경로의 다양성에 빛이 나 고가 면 meiosis reinitiation의 발병 증가, 하지 oocyte 캠프 레벨의 감소와 관련 된 고유 모델을 제공 합니다.
인간의 정자에서 Calmodulin, 및 Pde3a와 함께 복잡 한 안정으로 기존 순환 뉴클레오티드 Phosphodiesterases PDE1A의 존재
포유류 정자 운동 성, capacitation, 및 acrosome 반응 두 번째 메신저로 캠프와 관련 된 신호 전달 시스템에 의해 규제 됩니다. 캠프의 레벨 adenylyl cyclase 및 phosphodiesterases (PDEs) 후자 되 고 캠프 저하에 관련 된 두 가지 핵심 효소에 의해 제어 됩니다. Calmodulin 종속 PDE (PDE1) 및 캠프 관련 PDE (PDE4) 활동 이전에 특정 억제제를 사용 하 여 정자에서 확인 되었다. 여기서 우리는 인간의 정자 PDEs 플라즈마 멤브레인 (50%-60%) 뿐만 아니라 미 립 자 분수 (30%-50%)와 연결 되며 cGMP 보다 캠프에 대 한 더 많은 선호도 보고 합니다. Immunocytochemical 데이터 표시 PDE1A, 변종 PDE1, 신설, 중앙과 주 조각 뿐만 아니라 정자 머리의 적도 세그먼트에 지역화 된 PDE3A 정자 머리의 postacrosomal 세그먼트에서 발견 된다. Immunoblotting 분신에 isoforms PDE1A 및 pde3a의 존재를 확인 했다. Milrinone, PDE3 억제제 캠프 세포내 수준의 약 15% 증가 하지만 미치지 않 았 어 정자 기능 가능 하 게 PDE3 정자 총 PDE 활동의 단지 작은 비율을 나타내므로 (10%와 25 %x-100 가용성과 미 립 자 분수에 각각). PDE1A 전체 정자 추출 또는 부분 정화 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 칼슘 + calmodulin에 의해 자극 하지는 후 활동. 기본 조건에서 전기 이동 법으로 얻은 결과 표시는 calmodulin pde1a에 밀접 하 게 바인딩됩니다. EGTA + EDTA, trifluoperazine, 또는 우 레 아와 함께 부 화 PDE1A calmodulin 복잡 한을 분열 하지 않았다. 이 결과 PDE1A 인간의 분신에 영구적으로 활성화 됩니다 것이 좋습니다.
인간의 정자 Capacitation 및 Acrosome 반응 중 단백질 키 니 아 제 A의 활성화
분신 다양을 한 그들의 생활 동안 그들의 성숙과 계란을 기름 지 게 하는 기능을 위한 전제 조건은 변경 받 다. 포유류 정자 capacitation 및 acrosome 반응 두 번째 메신저로 주기적 아데노신 monophosphate (캠프)와 관련 된 신호 전달 시스템에 의해 규제 됩니다. 이 두 번째 메신저는 단백질 키 니 아 제 A (PKA)의 활성화를 통해 작동 하 고 단백질 티로신 인 산화를 직접 조절. 캠프 레벨 제어 (PDEs) phosphodiesterases 및 adenylyl cyclase (AC) 효소 활동의 균형에 의해 하는 책임은 저하와 생산, 각각. 이 연구의 목적은 태아의 코드 혈 청 ultrafiltrate (FCSu)에 의해 유도 된 인간의 정자 capacitation 및 칼슘 ionophore a23187에 의해 유도 된 acrosome 반응 하는 동안 캠프의 세포내 수준과 PDE, PKA 활동 사이의 가능한 관계를 평가 하는. 우리 보고 PKA 활동 noncapacitating 정자에서 보다 capacitating에서 높았다 고 캠프의 세포내 수준 감소 하지만 그 PDE 활동 capacitation 동안 일정 하 게 유지 합니다. A23187에 의해 유도 된 acrosome 반응 PDE 활동에만 캠프와 PKA 활동 증가와 연관 되었다. 이러한 결과 강하게 PDE 활동 정자 capacitation 및 acrosome 반응을 하는 동안 일정 때문 net 캠프 농도 AC, 통제 하는 것이 좋습니다. 또한, 결과 캠프의 저급은 capacitation 및 PKA의 활성화에 대 한 충분 한 및/또는 캠프 농도 측정 전체 정자에서 이러한 셀의 특정 구획에 효과적인 세포내 캠프 레벨을 반영 하지 않는 것이 좋습니다.
생리 및 Proteomic 인간에서 Prefertilization 이벤트를 공부 하 고 접근 한다
이 연구 목표로 첫째 성숙한 인간의 정자 수정, 준비 방법 세포질이 고 분자 측면에서 이해 하 고 둘째, 식별 하기 위해 어떤 요소가 계란과 정자 사이 초기 신호 상호 작용에 관련 된. 이러한 목표를 달성 하기 위해 방법 조합 사용, 단일 셀 영상 패치 클램핑과 proteomics를 포함 됩니다. 싱글 셀 이미징 숨겨진된 복잡성과 분신에 응답 신호에 질을 보여준다. 단일 셀 수준에서 세포 생리학의 패치 클램핑 하 여 이온 채널 식 연구 기능을 포함 하 여 미래의 목표 여야 합니다. 예를 들면 globozoospermia와 함께 그 남자의 특정 하위 그룹에 단백질 표정에서 결함 식별 겨냥 Proteomic 실험. Prefertilization 이벤트의 더 나은 이해를 비 보조 생식 요법의 개발, 남성 불 임에 대 한 치료 약물에 기초를 둔 수 있게 됩니다.
돼지 정자 Capacitation 및 단백질 티로신 인 산화 동안 캠프의 의미
두 번째 메신저는 정자 잠재력, 비 옥에 관련 된 운동 성 및 acrosome 반응 캠프에 의해 영향을. 또한, 주기적 뉴클레오티드의 활동은 포유류 정자에서 capacitation와 관련 된 티로신 phosphorylated 정자 단백질의 모양에 연루 이다. 그럼에도 불구 하 고, 돼지 정자 capacitation 동안 캠프/단백질 키 니 아 제 (PK-A) 통로의 참여 다른 포유동물에서 관찰 하는에서 다를 수 있습니다. 현재의 연구의 목표는 돼지 분신 capacitation 동안 캠프/PK-A 통로 명확 하 게 그리고 p32 정자 티로신 phosphoprotein 모양에이 영향을 평가. P32의 존재는 IBMX/db-캠프와 H-89, PK A 억제제 또는 bistyrphostin, capacitating (CM) 또는 비 capacitating immunoblotting SDS 추출 및 분리 된 정자 단백질 안티-phosphotyrosine 항 체를 사용 하 여 조건 (NCM) 티로신 키 니 아 제 억제 물 신선한 돼지 정자 잠복기 후 평가 되었다. 언제 돼지 분신 cm H-89 보완 incubated 했다 (50 microM) 또는 bistyrphostin (1.2 microM), capacitation 크게 감소 했다 (P < 0.001). 이전에 비록이 현상의 끝 포인트를 반드시 돼지 정자 capacitation 연결 되도록 표시 p32 정자 티로신 phosphoprotein IBMX/db-캠프 (100 microM/1 m m), H-89에 의해 변조 하지는 (50 microM) 이나 bistyrphostin (1.2 microM). 따라서, 우리의 결과 돼지 정자는 규제 다소 다르게 보다 다른 포유류에 대 한 설명 된 대로 캠프/PK-A와 티로신 키 니 아 제 경로 capacitation에 관련 된, 하지만 그들은 할 하지 p32의 모양에 영향을 때문에 나타냅니다.
티로신 키 니 아 제 활동에 멧돼지 정자 Capacitating를 Phosphoproteomics의 사용. 키 니 아 제 활동 및 Capacitation입니다
그것은 일반적으로 허용 그 정자 capacitation 단백질 키 니 아 제 티로신 phosphoproteins의 모양 한 중재와 관련 된 있지만 기판 및 kinase(s) 관련된 확인 하지 않았다. 우리 미스터 32000 티로신 phosphoprotein "p32" 돼지 정자 capacitation 일치에 나타나는 설명 합니다. 우리 또한 capacitation 중 향상 된 활동 미스터 32000 ("TK-32")의 멧돼지 정자에서 티로신 키 니 아 제 같은 효소를 발견 했다. 현재 작업 특성을 추가 하 고 이러한 capacitation 관련 protein(s) 확인을 실시 했다. 신선한 돼지 정자 capacitation 다음 immunoprecipitation 유도 incubated 했다, immunoblotting 및 proteomic 분석 공개 7 티로신 phosphorylated 단백질은 범위의 미스터 30000 다른 isoelectric pH 값 (pI)에 정렬 합니다. 따라서, p32 여러 티로신 phosphoproteins 구성 될 수 있습니다. 3 Acrosin 바인딩 sp32로 확인 됐다 (6.5 파이)와 두 개의 triosephosphate isomerase isoforms (pI 7.1 및 7.9). 그러나 현재,, proteonomic 분석 하지 드러났다 미스터 32000에서 어떤 아를. Immunoprecipitation 실험 p32와 TK 32 antiphosphotyrosine 침전의 상쾌한에 TK 32 활동 남아 서 다른 분자는 보여 줍니다. 마지막으로,에 젤 renaturation 및 immunoblotting TK 32 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)은 제안. P32와 MAPK 같은 TK 32 발견 돼지에서 capacitation 기본 메커니즘에 대 한 새로운 통찰력을 제공 합니다.
분 통로 Ca(2+)-ATPase (SPCA1) Ca(2) + 펌프, SERCAs 하지 조절 복합체 [인간의 정자에서 Ca(2+)](i) 신호
Endoplasmic sarcoplasmic 그물 Ca(2+) ATPase (SERCA) 억제제 thapsigargin (0.1-1 microM) 및 cyclopiazonic 산 (10 microM) [Ca(2+)] 인간의 정자에서 휴식에 영향을 하지 못했습니다. 천천히 황 체 호르몬 유도 [Ca (2 + i)](i) 진동 주기적 비우는-채우는 세포내 Ca(2+) 저장소를 포함 하는 인간의 정자에도 했다 이러한 억제제에 민감합니다. [Ca(2+)](i)와 진동에 대 한 부분, 복용량 의존 장애 휴식의 thapsigargin (5-30 microM, 50-300 번 SERCA 저해에 대 한 saturating 복용량) 인 한 상승의 비 선택적 복용량. 둘 다를 억제 하는 bis (2-hydroxy-3-tert-butyl-5-methyl-phenyl) 메탄 (두번째-페 놀)의 10-40 microM 농도 thapsigargin 구분 및-구분 microsomal Ca(2+) ATPases, 휴식 [Ca(2+)](i) 및 억제 [thapsigargin 저항 하는, microsomal Atpase의 저해와 일치 복용 Ca(2+)](i) 진동. 및 저장 된 ca(2+)의 해방의 해발 고도 발생 두번째-페 놀의 낮은 복용량 [Ca(2+)](i) 진동 속도 론에 영향을 표시 했다. 셀 이전에 황 체 호르몬을 자극된 하는 약물의 응용 효과 매우 관찰 때 황 체 호르몬에 의해 유도 된 지속적인된 Ca(2+) 유입 Ca(2+) 저장소의 동원을 통해 중재 하지 제안 unstimulated 셀에 적용 된 것과 유사 했다. 인간의 정자 단백질을 위한 서쪽 blotting 분 통로 Ca(2+) ATPase (SPCA1)의 표현으로 나타났다. Immunolocalisation 연구는 midpiece로 확장, 핵의 뒤에 지역에 있는 모든 셀의 spca1의 식을 공개 했다. 얼룩 SERCA, 병렬로 수행에 대 한 기술 중 하나를 사용 하 여 아무 식을 발견 했습니다. 우리는 결론: (1) 세포내 Ca(2+) 저장소 및 저장소 종속 [Ca(2+)](i) thapsigargin/cyclopiazonic 산을 구분 하지 않는 Ca(2+) 펌프, 체세포;의 특징으로 SERCA 아니다에 주로 의존 하는 인간의 정자에서 진동 (2) 정자에 대 한 높은 복용량 thapsigargin의 효과 주로 비 Sercas에 관련 되지 않은 작업 반영 하 고; (3) 분 통로 Ca(2+) ATPases 기여 적어도이 SERCA Ca(2+) 펌프 활동의 한 부분.
정자 계산을 더 이상 추가 하지 않습니다: 새로운 방정식에 대 한 시간?
정자 기능 장애 불 임의 하나의 가장 흔한 원인 이지만, 우리는 불 쌍 한 방식의 진단과 놀라울 정도로 효과적인 치료 (보조 생식 기술 제외). 이 리뷰에서 우리 기본 정액 분석의 유용성도 전하고 새로운 패러다임 즉시 필요 하다는 주장. 우리는 재택 심사 잠재적으로 남성의 진단 개선 하 고 sub-fertile 커플 관리 합리화를 사용 하 여 논의. 또한, 우리는 정자 함수의 새로운 바이오 마커의 개발 하면 proteomics에 필드에서 최근 진행 상황을 예를 들어, 간략하게 설명 합니다. 이 새로운 지식과 시스템으로는 정자의 우리의 이해를 변형 시킬 것 이다 정자 기능 장애를 가진 남자에 대 한 비-예술 치료로 이어질 가능성이 높습니다.
인간의 정자 단백질 S Nitrosylation에 대 한 여러 개의 목표를 포함: 산화 질소에 의해 정자 기능 변조의 대체 메커니즘?
산화 질소 (NO)는 인간의 정자 운동 성 및 capacitation 증가 단백질 인 산화와 관련 된 향상 시킵니다. 아니 용 해 guanylyl cyclase를 활성화 하지만 炭 시스테인의 S-nitrosylation를 통해 단백질의 기능을 수정할 수도 있습니다. 놀랍게도,이 메커니즘 함수 정의에 필요한 변화를 달성 하기 위해 닢 단백질 수정 있지만 정자에 미개척 남아 있습니다. 우리의 목표는 인간의 정자에 S nitrosylation에 대 한 목표를 확인 했다. 분신 했다 아무 기증자와 인 큐베이 팅 및 S nitrosylated 단백질 MS/양 240 S nitrosylated 단백질 S-nitroso-glutathione를 incubated 정자에서 발견 된 biotin 스위치 분석 결과 및 사용 하 여 proteomic 접근을 사용 하 여 발견 했다. 최소한의 수준은 glutathione 또는 치료 샘플에서 관찰 되었다. 일관 되 게 확인 된 단백질 기반 여러 개의 펩 티 드에 포함 된 설정 된 목표 다른 S-nitrosylation tubulin, GST와 HSPs 예를 들어 셀에 대 한 소설 대상 A 키 고정 단백질 (AKAP) 유형 3, 4, 전압 종속 음이온 선택적 채널 단백질 3, semenogelin 1, 2 등. 현장에서 현지화를 신설에 걸쳐 머리의 postacrosomal 영역에 S nitrosylated 대상 공개. 인간의 정자에 S nitrosylation에 대 한 잠재적인 대상 다른 셀에 이전에 보고 된 순수 중요 한 단백질을 포함. 그들의 식별 아니 분신의 행동의 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공할 것입니다.
인간의 정자-flagellar 활동의 규제에 대 한 메커니즘의 목 지역에 저장 된 칼슘의 동원
칼슘 신호 전달 acrosome 반응과 chemotaxis hyperactivation의 규정에 밀접 하 게 관련 되 고 정자 생리학에서 중추적인 역할을 한다. 여기 우리 체세포와는 이러한 메커니즘 기능 성숙 정자에 적응 되어 있는 방법에서 칼슘 조절 메커니즘 간략하게 설명 합니다. 우리는 다음 세 가지 화합물이 고 정자의 반응에 다른 실험실에서 최근 데이터 고려: 황 체 호르몬과 질소의 산화물 (적 운 oophorus의 두 제품 모두) 및 4-aminopyridine. 이러한 화합물의 모든 후부 정자 머리와 목 지역에 칼슘 신호를 유발 하 고, 적절 한 농도에서 적용 될 때 수정 flagellar 활동, 근 위 신설의 비대칭 휨 발생. 우리는 이러한 효과 반영 작업, 정자 목 지역에 저장 된 칼슘의 동원의 공통 모드 주장 한다. 마지막으로 우리는 칼슘 신호 전달 경로에 정자의 특성을 고려 하십시오. 이 높은 전문 하 고 비록 그 체세포, '도구' 신호 같은 칼슘 사용 매우 polarised 셀 자극을 통합 하는 행동 하지 않으면 비정상적으로 '유선' 칼슘 신호를 생성 하도록 사용 하는 것이 좋습니다. ' 누설 '이 칼슘 신호 전달 경로 부적 절 한 응답 생성, 세포의 기능 저하 사이.
Ca2 + 상점 및 S Nitrosylation에 의해 인간의 정자 Flagellar 규정의 동원: 여성의 생식 기관에 Synthesised 없음에 대 한 역할
산화 질소 synthase (NOS) 하 여 NO의 생성은 생식 체 상호 작용 및 수정에 연루. 아무 기증자에 게 인간의 분신의 노출 guanylate cyclase의 활성화를 필요로 하지 않았다 하지만 S-nitroso-glutathione (GSNO; S-nitrosylating 에이전트)에 의해 유사 했다 메커니즘에 의해 저장 된 ca(2+)의 동원을 발생 합니다. 활용 dithiothreitol, 단백질-SNO 그룹을 줄이기 위해 급속 하 게 반전 없음 작업 및 GSNO에 [Ca(2+)](i). 효과 없음, GSNO 및 dithiothreitol 정자 단백질 S-nitrosylation, biotin 스위치 메서드를 사용 하 여 평가에 밀접 하 게 paralleled [ca(2+)](i)에 그들의 행동. Immunofluorescent 얼룩 인간의 란 고 적 운 (투자는 oocyte 셀룰러 레이어)에서 제정 하 고 유도할 수 있는 NOS 공개. 4, 5-diaminofluorescein (DAF) 얼룩의 이러한 조직에 의해 생산을 시연 했다. 란 explants와 인간의 정자의 인큐베이션 정자 단백질 S nitrosylation 닮은 기증자와 GSNO에 의해 유도 된 유도. 황 체 호르몬 (적 운 셀 제품)도 인간의 정자 저장된 Ca(2+) mobilises. 전처리 없이 정자의 크게 향상 [flagellar 여행에서 장기간된 증가의 결과로, ca(2+)](i)에 황 체 호르몬의 영향. 우리는 결론 아니 조절 단백질 S nitrosylation에 의해 인간의 정자에 저장 된 ca(2+)이이 작업은 황 체 호르몬의 시너지와이 성분이 생식 체 상호 작용 정의로 이어지는에서 잠재적으로 매우 중요 한의 학자의.
Ca2 +-정자에 저장: 자신의 정체성과 기능
세포내 Ca2 + 매장 휴대 [ca2+](i)와의 복잡 한 신호 [Ca2 +] 진동 및 파도 같은 세대 규제에 중심 역할을. Ca2 + 신호 정자 세포, 많은 주요 활동 (capacitation, hyperactivation, chemotaxis 및 acrosome 반응 포함)에서 중앙 레 귤 레이 터는 아직 성숙한 정자 부족 endoplasmic 그물에 Ca2 + 체세포에 저장 역할을 하는 몇 가지 다른 organelles 특정 의미 중 하나입니다. 여기, 우리 i) 분자 부품 (펌프 및 채널)는 기능적으로 Ca2 + 상점 체세포의 활동에서 중요 한의 정자에 식에 대 한 증거 및 ii) 기능 Ca2 + 점포 정자의 존재에 대 한 증거를 검토. 이 증거 포유류 정자, acrosomal 지역에서 나타나고 다른 정자 목 midpiece 지역에 두 개 이상의 스토리지 organelles의 존재를 지원합니다. 우리가 다음 이러한 organelles와 개별 기능의 가능성이 정체성을 논의로 이동: 자체의 분 비와 정자 목에 막 organelles, (그리고는 미토 콘 드리 아에 의해) 규제는 acrosome에서 규정 flagellar 활동 및 hyperactivation. 마지막으로, 우리 몰래 이러한 저장소의 동원 및 포유류 정자의 활동 규제에 주 조각에서 CatSper 채널의 저장 Ca2 + 정자 목/midpiece에서 기능 상호 작용을 제어 하는 정자의 기능을 고려 하십시오.
여성 요로 정자 간의 통신: 말 NO * 네 뜻
통해 신호 [Ca(2+)](i) 정자 활동의 규제 중심 이다 고 정자 운동 성을 조절 하는 여성 생식 관에서 신호 transduces 메커니즘을 될 것입니다. 우리가 보여준 최근 paper1에서 정자의 산화 질소에 노출 동원 인간의 정자, 단백질 thiols의 nitrosylation을 통해 발생 하는 효과에 저장 된 Ca(2+). 뿐만 아니라 우리가 * 인간의 여성 관의 세포에 의해 생산을 유도 하지만, 여성의 요로도 이며 NO * 동원 Ca(2+) 및 flagellar 박동 향상 synergistically 행동 oocyte 제의 의해 합성 황 체 호르몬이이 효과 충분 한 것을 알았다. 여기 우리 정자 머리와 신설의 교차점에서 Ca(2+) 저장소에 황 체 호르몬과 NO *에 한 규제는가 게에서 ryanodine 수용 체는 우연의 일치에 탐지 하 고 상호 시너지 작용 발생 지점 수 있습니다 논쟁.
