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Articles by Michael E. Werner in JoVE
JoVE Bioengineering
Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation
1Laboratory of Nano- and Translational Medicine, Department of Radiation Oncology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 2Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University of North Carolina
Questo articolo descrive un metodo per sintetizzare nanoprecipitation polimero a base di nanoparticelle utilizzando diblock co-polimeri. Discuteremo la sintesi di copolimeri diblock, la tecnica nanoprecipitation e potenziali applicazioni.
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Ruolo Cruciale Del Ciclo Specificità-determinazione Della Subunità Beta4 Integrina Nell'associazione Di Cellule Di Trasduzione Del Segnale Esterno-in E Laminina-5
All'interno di ciascun Emidesmosoma, integrina alpha6beta4 gioca un ruolo cruciale nell'Emidesmosoma assembly dal legame con la laminina-5 nella zona di membrana basale del tessuto epiteliale. Recenti analisi hanno implicato "loop di specificità-determinazione" (SDL) nel dominio di integrina beta nella regolazione della associazione ligando-like. Qui, abbiamo studiato la funzione di un motivo di SDL-come all'interno del dominio extracellulare-come di integrina beta4. Abbiamo generato mutazioni puntiformi all'interno di SDL di integrina beta4 taggato con proteina fluorescente verde (GFP-beta4K150A e GFP-beta4Q155L). Abbiamo anche generato una mutazione all'interno del dominio-come l'integrina beta4, situata di fuori della regione SDL (GFP-beta4V284E). Abbiamo transfected costrutti codifica le integrine beta4 mutato e un coniugato GFP wild type beta4 integrina (GFP-beta4WT) in cellule G 804, che assembla emidesmosomi, e cellule endoteliali umane, che esprimono poco integrina beta4 endogeno. In celle transfected 804 G, GFP-beta4WT e GFP-beta4V284E colocalize con Emidesmosoma proteine, considerando che hemidesmosomal componenti in cellule che esprimono GFP-beta4K150A e GFP-beta4Q155L sono localizzati in modo anomalo. Nelle cellule endoteliali, GFP-beta4WT e proteine mutanti sono espressi sulla superficie delle cellule con integrin alpha6. Quando transfected le cellule endoteliali sono placcate su matrice laminina-5, GFP-beta4WT e GFP-beta4V284E localizzare con la laminina-5, mentre GFP-beta4K150A e GFP-beta4Q155L non. GFP-beta4WT e GFP-beta4V284E espresso nelle cellule endoteliali associate con la proteina dell'adattatore Shc quando le cellule sono stimolate con laminina-5. Tuttavia, GFP-beta4K150A e GFP-beta4Q155L non riescono ad associare con Shc anche quando la laminina-5 è presente, quindi un impatto di segnalazione a valle. Questi risultati forniscono evidenza che il segmento SDL della subunità di integrina beta4 è richiesto per l'associazione del ligando ed è coinvolto in esterno di segnalazione.
L'alfa Di Proteina Shock Termico Piccolo B Crystallin è Un Inibitore Del Romanzo Di Apoptosi Indotta Da TRAIL Che Sopprime L'attivazione Delle Caspasi-3
Fattore di necrosi tumorale-correlati che inducono apoptosi ligando (sentiero) è un membro della famiglia di fattore di necrosi tumorale alfa di citochine che preferenzialmente induce apoptosi nelle cellule trasformate, rendendolo una promettente terapia contro il cancro. Tuttavia, molte neoplasie sono resistenti all'apoptosi indotta da TRAIL da meccanismi che sono scarsamente compreso. Dimostriamo che l'espressione di Alfa proteina shock termico piccolo B-crystallin (ma non altre proteine di scossa di calore o le proteine che regolano il apoptosis) correla con resistenza TRAIL in un pannello di linee di cellule tumorali umane. L'espressione stabile di selvaggio-tipo alpha B-crystallin, ma non un mutante di pseudophosphorylation alterata nella sua funzione di Assemblea e chaperone, protegge le cellule tumorali da TRAIL-indotta di attivazione di caspase-3 e l'apoptosi in vitro. Inoltre, inibizione selettiva di alfa B crystallin espressione di interferenza del RNA sensibilizza le cellule tumorali a sentiero. Inoltre, alfa selvaggio-tipo B-crystallin promuove la crescita tumorale xenoinnesto e inibisce l'apoptosi indotta da TRAIL in vivo in topi nudi, considerando che un alfa pseudophosphorylation B crystallin mutante alterata nella sua funzione di anti-apoptotic inibisce la crescita tumorale xenoinnesto. Collettivamente, questi risultati indicano che l'alfa B crystallin è un romanzo regolatore di crescita di tumore e apoptosi indotta da TRAIL. Inoltre, questi risultati dimostrano che inibizione mirata della alpha B-crystallin favorisce l'apoptosi indotta da TRAIL, suggerendo così una romanzo strategia per superare la resistenza di TRAIL in cancro.
AlphaB-crystallin è Un Romanzo Oncoproteina Dei Tipo Che Predice L'esito Clinico Povero Nel Cancro Al Seno
Recenti studi di analisi genica hanno identificato un nuovo sottotipo di tumore al seno, il gruppo basale-like, che esprime la caratteristica di geni di cellule epiteliali basali ed è associata a scarsi risultati clinici. Tuttavia, i geni responsabili del comportamento aggressivo, osservato in questo gruppo sono in gran parte sconosciuti. Qui riportiamo che il calore piccola scossa della proteina alfa-basic-crystallin (alphaB-crystallin) era comunemente espressa in basale-come tumori e predisse scarsa sopravvivenza nei pazienti con cancro al seno indipendentemente dagli altri marcatori prognostici. Abbiamo anche dimostrare che sovraespressione di crystallin alphaB trasformato immortalate umane cellule epiteliali mammarie (MECs). Nella membrana basale 3D cultura, alphaB-crystallin sovraespressione indotta da riempimento luminale e altre modifiche simil-neoplastico in acini mammari, mentre silenziamento alphaB-crystallin di interferenza del RNA inibito queste anomalie. alphaB-Crystallin sovraespressione indotta anche crescita EGF - e ancoraggio-indipendente, cellula aumentata migrazione e invasione e costitutivamente attivato il percorso MAPK chinasi/ERK (MEK/ERK). Inoltre, il fenotipo trasformato conferito da alphaB-crystallin fu repressa da inibitori MEK. Inoltre, immortalata MECs umano con sovraesprimono relativa alphaB-crystallin formato carcinomi mammari invasivi in topi nudi che ricapitolate aspetti di tumori al seno basale-come umano. Collettivamente, i nostri risultati indicano che alphaB-crystallin è oncoproteina di un romanzo tipo espresso nel carcinoma al seno basal-like che predice indipendentemente la sopravvivenza più breve. I nostri dati coinvolgono anche il percorso MEK/ERK come un potenziale bersaglio terapeutico per questi tumori.
Caspase Proteolisi Della Subunità Beta4 Integrina Sconvolge Emidesmosoma Assembly, Promuove L'apoptosi E Inibisce La Migrazione Delle Cellule
Caspases sono una famiglia conservata delle proteasi di morte delle cellule che fendere substrati intracellulari a residui Asp a modificare la loro funzione e promuovere l'apoptosi. In questa relazione ci identifichiamo la subunità di integrina beta4 come substrato romanzo caspase utilizzando un'espressione di strategia la clonazione. Insieme al suo partner alpha6, integrina alpha6beta4 ancore le cellule epiteliali per la membrana basale presso strutture specializzate adesivi conosciuto come emidesmosomi e gioca un ruolo fondamentale nelle funzioni delle cellule epiteliali diversi tra cui la migrazione e la sopravvivenza delle cellule. Mostriamo che beta4 integrina è fenduta da caspase-3 e -7 ad un residuo conservato di Asp (Asp(1109)) in vitro e in cellule epiteliali in fase di apoptosi, con conseguente rimozione della maggior parte della sua coda citoplasmatica. Scissione di caspase dell'integrina beta4 produce due prodotti, 1) un prodotto carbossi-terminale che è instabile e rapidamente degradate dal proteasoma e 2) un prodotto di scissione del amminico-terminale (aminoacidi 1-1109) che è in grado di assemblare in emisomi maturo. Abbiamo anche dimostrare che caspase scissione dell'integrina beta4 sensibilizza le cellule epiteliali all'apoptosi ed inibisce la migrazione delle cellule. Presi insieme, abbiamo identificato un troncamento proteolitico precedentemente non riconosciuto di integrina beta4 generati dai caspases che sconvolge la chiave proprietà strutturali e funzionali delle cellule epiteliali e promuove l'apoptosi.
Fosforilazioni Specifica Tirosina Mediano Segnale-dipendente Dalla Stimolazione Dell'attività Della Fosfatasi Di SHIP2 Inositolo, Mentre Il Dominio SH2 Conferisce Un Effetto Inibente Per Mantenere L'attività Basale
SH2 dominio contenenti fosfatasi 5-inositolo (SHIP2) è implicata nello sviluppo del cancro e il diabete di tipo 2. La fosforilazione della tirosina di SHIP2 è indicata per migliorare la sua attività di fosfatasi. Usando IP4 come substrato, mostriamo qui che tirosine 986, 987 e 1135 sono critici per la stimolazione indotta da EGF di attività SHIP2. SHIP2 con un dominio SH2 perturbato (mutazione R47G) Visualizza maggiore attività costitutiva di selvaggio-tipo SHIP2. Delezione della regione C-terminale attiva allo stesso modo SHIP2. Pertanto, il dominio SH2 di SHIP2, in collaborazione con il C-terminale, conferisce un effetto inibente per mantenere una bassa attività basale e fosforilazioni tirosina indotta da segnale superare questo effetto per attivare SHIP2.
Regolazione Della Contrattilità Corticale E Mandrino Posizionamento Da Fosfatasi Della Proteina 6 PPH-6 in Embrioni in Fase Uno-cella C. Elegans
Modulazione del microtubulo e il citoscheletro di actina è fondamentale per la corretta divisione delle cellule. Fosforilazione della proteina è noto per essere un importante meccanismo di regolamentazione modulante queste reti citoscheletriche. Al contrario, c'è una relativa scarsità di informazioni riguardanti come protein fosfatasi contribuiscono a tale modulazione. Qui, ci caratterizzano i requisiti per la proteina fosfatasi PPH-6 e sua subunità associato SAPS-1 in embrioni in fase uno-cella C. elegans. Stabiliamo che il complesso di PPH-6 e SAPS-1 (PPH-6/SAPS-1) è richiesto per la contrattilità della rete actomiosina e mandrino corretto posizionamento. La nostra analisi dimostra che PPH-6/SAPS-1 regolamenta l'organizzazione della miosina non-muscolare corticale II (NMY-2). Di conseguenza, noi scoprire che PPH-6/SAPS-1 contribuisce alla Citocinesi in contrattilità actomiosina stimolante. Inoltre, dimostriamo che PPH-6/SAPS-1 è necessario per la corretta generazione della tirando le forze sui pali del mandrino durante l'anafase. I nostri risultati indicano che questo requisito è distinto dal ruolo nell'organizzare la rete corticale actomiosina. Invece, noi scoprire che PPH-6/SAPS-1 contribuisce alla localizzazione corticale di due regolatori positivi della tirando le forze, GPR-1/2 e LIN-5. I nostri risultati forniscono il primo nel ruolo di un membro della famiglia PP6 della fosfatasi in sviluppo metazoi.
Consegna Mirati Folato Nanoparticella Di Chemio - E Radiotherapeutics Per Il Trattamento Delle Metastasi Peritoneale Cancro Ovarico
Metastasi peritoneale sono delle principali cause di morbilità e mortalità nel cancro ovarico. Mentre la radioterapia e la chemioterapia intraperitoneale hanno mostrato risultati clinici favorevoli, entrambi sono limitati per loro natura non mirati. Abbiamo mirato a sviluppare una nanoparticella biologicamente mirata terapeutica per il trattamento delle metastasi peritoneale cancro ovarico. Nanoparticelle mirati folato incapsulamento di chemioterapia o radioterapia sono state progettate. Paclitaxel (Ptxl) è stato usato come i chemioterapici e yittrium-90 ((90) Y) fu impiegato come il radioisotopo terapeutico. Folato è stato utilizzato come il ligando bersaglio come la maggior parte dei tumori ovarici iperesprimono il recettore di folati. Gli studi di caratterizzazione di nanoparticelle hanno mostrato monodispersed particelle con rilascio controllato Ptxl. Folati targeting ligand mediato l'assorbimento di NPs in cellule tumorali. In vitro studi di efficacia dimostrata NPs mirati folato contenente chemioradioterapia è stato confrontato terapeutico più efficace di folati-mirati NPs contenente un singolo terapeutico o eventuali terapie NP non mirati. Studi di efficacia in vivo, utilizzando un modello di metastasi peritoneale ovarico ha mostrato quello therapeutics NP mirati di folato erano significativamente più efficaci terapie NP non mirati. Tra il folato mirati therapeutics, NP contenente chemioradioterapia sembrava essere il più efficace. I nostri risultati suggeriscono che nanoparticelle mirati folato contenente chemioradioterapia hanno il potenziale come un trattamento per metastasi peritoneale ovarica.
Actina E I Microtubuli in Auto Gli Aspetti Differenziali Della Polarità Planare Delle Cellule in Cellule Multiciliated
Polarizzazione planare delle cellule rappresenta la capacità delle cellule di orientarsi all'interno del piano di un tessuto ortogonale all'asse basale apicale. La corretta funzione polarizzata delle cellule multiciliated richiede il coordinamento delle ciglia spaziatura e polarità cilia nonché la tempistica delle ciglia battendo durante metachronal sincronia. Le forze idrodinamiche e via di polarità planare delle cellule hanno dimostrate di istruire la polarità di ciglia. In questo articolo, mostriamo effettori intracellulari come interpretare la polarità per organizzare la morfologia cellulare secondo asimmetrico funzione cellulare. Osserviamo che sia actina cellulare e reti microtubule subiscono drastica riorganizzazione, fornendo un differenziali ruoli durante l'organizzazione polarizzata delle ciglia. Utilizzando l'analisi computazionale correlazione angolari di orientamento cilia, riportiamo un'organizzazione cellulare graduata a valle dei segnali di polarità delle cellule. Actina dinamiche sono richiesti per ciglia corretta spaziatura, coordinamento globale delle polarità ciglia e coordinamento di metachronic cilia battendo, considerando che dinamiche dei microtubuli citoplasmatici sono necessarie per il coordinamento locale di polarità tra vicini ciglia.
Formulazione Di Nanoparticelle Polimeriche Folato Mirati Di Docetaxel è Un Efficace Radiosensitizer Molecolarmente Mirati Con Efficacia Dipendono I Tempi Di Radioterapia
Chemioterapici delle nanoparticelle (NP) tengono il grande potenziale come radiosensitizers. Loro proprietà uniche, come accumulo preferenziale in tumori e la loro capacità di tumori di destinazione attraverso ligandi targeting molecolare, sono ideali per radiosensitization. Abbiamo mirato a sviluppare una nanoparticella molecolarmente mirata formulazione di docetaxel (Dtxl) e valutare le sue proprietà come un radiosensitizer. Utilizzando una piattaforma NP lipido-polimeri biodegradabili e biocompatibili e folati come un ligando targeting molecolare, abbiamo progettato una nanoparticella mirati di folato (FT-NP) formulazione di Dtxl. Questi criteri hanno dimensioni di 72 ± 4 nm e superficiale accusa di mV ± 8-42. Usando folato recettore all KB e folati recettore basse HTB-43 cellule, abbiamo mostrato assorbimento intracellulare folato-mediata di NPs. Studi in vitro radiosensitization ha mostrato inizialmente CHE FT-NP è meno efficace di Dtxl come un radiosensitizer. Tuttavia, l'efficacia di radiosensitization dipende la tempistica di radioterapia. Radiosensitization in vitro condotto con irradiazione dato al momento ottimo (24 h) ha mostrato che dtxl FT-NP è efficace come Dtxl. FT-NP Dtxl è rispetto a Dtxl e nanoparticelle immaturi (NT-NP) è stato trovato per essere significativamente più efficace di Dtxl o NT-NP Dtxl come un radiosensitizer Dtxl in vivo, FT-NP. Abbiamo anche confermato che radiosensitization dipende dai tempi di irradiazione in vivo. In sintesi, Dtxl FT-NP è un efficace radiosensitizer in cellule tumorali all folato-recettore. Tempo di irradiazione è fondamentale nel raggiungere la massima efficacia con questa piattaforma di nanoparticelle. Al meglio delle nostre conoscenze, la nostra relazione è il primo a dimostrare il potenziale di NPs molecolarmente mirati come una promettente nuova classe di radiosensitizers.
