Cloning, Gewebeverteilung Und Funktionelle Expression Des Menschlichen G-Protein Beta 4-Untereinheit

Physiological Genomics. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11842130

Desensibilisierung Der Gruppe I Metabotropen Glutamat-Rezeptoren Bei Ratten Sympathischen Neuronen

Journal of Neurophysiology. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11929888

Die Bedeutung Der Gamma-Aminobuttersäure (B)-Rezeptor C-Termini Für G-Protein-Kopplung

Molecular Pharmacology. May, 2002  |  Pubmed ID: 11961124

M Aktuellen Bote Geheimnis Offenbart?

Neuron. Aug, 2002  |  Pubmed ID: 12165463

Metabotropen Glutamat-Rezeptor-Expression in Der Ratte Ganglion Cervicale Superius

Neuroscience Letters. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12270642

Die Spezifität Der Metabotropen Glutamat-Rezeptor-2 Kopplung an G-Proteine

Molecular Pharmacology. Jan, 2003  |  Pubmed ID: 12488551

Eine Spleißvariante Des G-Protein Beta 3-Untereinheit Bei Krankheitszuständen Beteiligt Nicht Modulieren Ionenkanäle

Physiological Genomics. Apr, 2003  |  Pubmed ID: 12595577

Endocannabinoide Modulieren N-Typ-Kalziumkanäle Und G-Protein-gekoppelten Einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle über CB1-Cannabinoid-Rezeptoren in Säugetierzellen Heterolog Neuronen Exprimiert

Molecular Pharmacology. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14978245

Modulation Von Ionenkanälen Und Synaptischen Übertragung Durch Einen Menschlichen Sensorisches Neuron-spezifische G-Protein-gekoppelten Rezeptors, SNSR4/mrgX1, Heterolog in Kultivierten Ratten-Neuronen Exprimiert Wird

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. May, 2004  |  Pubmed ID: 15163697

Die Expression Von G-Protein-Signalisierungs-Komponenten Bei Erwachsenen Säugetier-Neuronen Durch Mikroinjektion

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2004  |  Pubmed ID: 15250492

Verwenden Von RGS-und Kleinschreibung Galpha Untereinheiten Auf Endogene Protein RGS Aktion Auf G-Protein-Modulation Von N-Typ-Kalzium-Kanäle in Sympathischen Neuronen Zu Studieren

Methods in Enzymology. 2004  |  Pubmed ID: 15313566

Alternative Modalitäten Adenovirus-vermittelte Genexpression in Hippocampalen Neuronen Auf Mikroinsel Substrat Kultiviert

Neuroscience Letters. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15351453

Kupplung Des Glutamatrezeptors 8 Bis N-Typ-Ca 2 +-Kanäle in Ratten Sympathischen Neuronen

Molecular Pharmacology. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15755905

Ausdruck Der Rem2, Einer RGK-Familie Kleine GTPase Reduziert N-Typ-Kalzium-aktuelle Ohne Kanal Oberflächendichte

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16237180

Rad, Gem/Kir, Rem und Rem2 sind Mitglieder der Ras-bezogene RGK (Rad, Gem, und Kir) Familie kleine GTP-bindende Proteine. Heterologe Expression der RGK Proteine stört de Novo Kalzium-Kanal Montage/Drogenschmuggel und dramatisch sinkt die Amplitude der Strömungen, die aus bereits vorhandenen hohen Spannung-aktivierte Kalzium-Kanäle. Diese Effekte ergeben sich wahrscheinlich aus der direkten Interaktion von RGK-Proteinen mit Kalzium-Kanal-Beta-Untereinheiten. Unter der RGK-Familie ist Rem2 das einzige Mitglied, das reichlich in neuronalen Geweben ausgedrückt. Hier haben wir die Fähigkeit der Rem2, endogene Spannung aktiviert Kalzium-Kanälen in Ratte sympathisch und Dorsal Root Ganglion Neuronen zu modulieren. Heterologe Expression von Rem2 abgeschafft fast Kalzium Ströme entstehen aus bereits vorhandenen hohen Spannung-aktivierte Kalzium-Kanäle ohne niedrig-Spannung-aktiviert Kalzium-Kanäle. Rem2 Hemmung der N-Typ-Kalzium-Kanäle benötigt, die Ras-Homologiegebiet (Kern) und das polybasic C-Terminus. Mutation von einem vermeintlichen GTP / Mg2 + Bindung Motiv in Rem2 hatte keine Auswirkungen auf die Unterdrückung von Kalzium Ströme. Laden von Neuronen mit BIP-Beta-S über die Patch-Pipette Rem2-vermittelte Kalzium-Kanal-Hemmung nicht umkehren. Schließlich [(125) i] Tyr22-Omega-Conotoxin GVIA Zelle Oberfläche Bindung in tsA201 Zellen stabil ausdrückt N-Typ-Kalzium-Kanäle nicht war verändert durch Rem2 Ausdruck zu einer Zeit, die Kalzium aktuelle völlig abgeschafft war. Gemeinsam unterstützen unsere Ergebnisse ein Modells in dem Rem2 lokalisiert an der Plasmamembran über ein C-terminalen polybasic Motiv und interagiert mit Kalzium-Kanal-Beta-Untereinheiten in die vormontierte N-Typ-Kanal, damit eine nichtleitende Arten bilden.

Phosducin Und Phosducin-Like Protein Dämpfen G-Protein-gekoppelter Rezeptor-vermittelte Hemmung Der Spannung-Gating Kalzium-Kanäle in Ratte Sympathischen Neuronen

Molecular Pharmacology. Jul, 2006  |  Pubmed ID: 16608918

Phosducin (PDC) wurde in strukturelle und biochemische Experimente gezeigt, die Gbetagamma-Untereinheit des trimeren G-Proteine zu binden. Eine vorgeschlagene Funktion der PDC und Phosducin-wie Protein (PDCL) ist die Beschlagnahme von "frei" Gbetagamma von der Plasmamembran und damit zur Einstellung Signalisierung durch Gbetagamma. Die funktionelle Auswirkungen der heterologously exprimierten PDC und PDCL auf N-Typ-Kalzium-Kanal (CaV2.2)-Modulation wurde in sympathischen Neuronen, isoliert von Ratte überlegenen zervikalen Ganglien, mit ganz-Zellenspannung Klemme untersucht. Ausdruck von PDC und PDCL abgeschwächt Spannung-abhängigen Hemmung der N-Typ-Kalzium-Kanäle, eine Gbetagamma-abhängigen Prozess in einer zeitabhängigen Mode. Kalzium aktuelle Hemmung nach kurzfristigen Exposition gegenüber Noradrenalin durch PDC oder PDCL Ausdruck minimal verändert wurde. Jedoch in die weitere Präsenz der Noradrenalin entlastet PDC oder PDCL, Kalzium-Kanal-Hemmung gegenüber Steuerelement Neuronen. Wir beobachteten ähnliche Ergebnisse nach Aktivierung des heterologously exprimierten Metabotropic Glutamat-Rezeptoren mit 100 MicroM L-Glutamat. Neuronen ausdrückt, PDC oder PDCL gepflegt Unterdrückung der Hemmung nach erneute Exposition mit Agonist. Im Gegensatz zu anderen Gbetagamma erfordern absondern Proteine, die die kurzfristige Hemmung der Ca2 +-Kanäle, abzuschaffen PDC und PDCL verlängerte Agonist Exposition vor Auswirkungen auf die Modulation realisiert werden.

Photobleichung Von YFP Erzeugt Keine GFP-Arten, Die FRET Messungen Betrifft

Nature Methods. Jul, 2006  |  Pubmed ID: 16791204

Messung Der FRET-Effizienz Und Verhältnis Von Spender Zu Akzeptor Konzentration in Lebenden Zellen

Biophysical Journal. Sep, 2006  |  Pubmed ID: 16815904

Messung der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Effizienz und die relative Konzentration von Spender und Empfänger Fluorophore in lebenden Zellen mit dem drei-Filter Cube-Ansatz erfordert die Bestimmung von zwei Konstanten: 1), das Verhältnis von sensibilisierten Akzeptor Emission Spender Fluoreszenz abschrecken (G-Faktor) und 2), das Verhältnis von Spender/Akzeptor Fluoreszenz Intensität equimolar Konzentrationen in Ermangelung an FRET (k-Faktor). Wir entwickelten eine Methode zum Bestimmen von G und k, die nutzt zwei Spender-Akzeptor Schmelzverfahrensproteine mit unterschiedlichen FRET Effizienz – der Wert von denen nicht bekannt sein müssen. Wir überprüft die Methode durch Messung das FRET-Effizienz und Konzentration-Verhältnis von fluoreszierende Proteine Cerulean und Venus in den Säugetier-Zellen eine Reihe von Schmelzverfahrensproteine mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zum Ausdruck zu bringen. Die Methode wird quantitative FRET Messung in lebenden Zellen erheblich vereinfacht, da keine Zelle Fixierung, Akzeptor Photobleaching, Proteinreinigung, oder spezielle Ausrüstung zur Bestimmung der Fluoreszenz-Spektren oder Lebensdauer erforderlich ist.

Leichte Inaktivierung Fluorophor-assistierte Produziert Sowohl Gezielte Und Collateral-Auswirkungen Auf Die N-Typ Kalzium-Kanal-Modulation in Ratte Sympathischen Neuronen

The Journal of Physiology. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16873413

Fluorophor-assistierte Licht Inaktivierung (FALI) ist eine Methode, um spezifische Proteine auf einer Zeitskala von Sekunden bis Minuten mit entweder diffus oder kohärentes Licht zu inaktivieren. Hier untersuchen wir eine neuartige FALI-Modalität, die ein Fluoreszein-konjugierten Polypeptid, Alpha-Bungarotoxin (BTX) und ein 13 Aminosäure BTX-verbindliche Site entwickelt, in der N-Terminus des Metabotropic Glutamate Rezeptor 8a verwendet (mGluR8a), ein Klasse C G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR). Die markierte mGluR8a wurde in Ratte sympathischen Neuronen exprimiert und mit Fluoreszein-konjugierten BTX (FL-BTX). Die Wirksamkeit der FALI wurde beurteilt durch die Überwachung der mGluR8a-vermittelte Hemmung der Kalzium Ströme (I(Ca)) mit ganz-Zell-Spannung Klemm-Techniken. Nach entweder Breite-Feld oder Laser-Beleuchtung FL-BTX-gekennzeichnet Neuronen, mGluR8a-vermittelte I(Ca) Hemmung stark abgeschwächt wurde, während aktuelle und basale I(Ca), Maßnahmen der unspezifischen Effekte, halten waren minimal betroffen. Natriumazid, eine Kollision Quencher von Singulett-Sauerstoff, verringert das Ausmaß der FALI-vermittelte Effekte eine Rolle für reaktive Sauerstoffspezies im Prozess zu unterstützen. Obwohl diese Ergebnisse mit einer akuten Inaktivierung von mGluR8a, das beabsichtigte Ziel waren vermischt zwei Feststellungen dieser Interpretation. Einerseits Auswirkungen auf eine nativ exprimierten Signalweg, Alpha (2)-adrenerge Rezeptor-vermittelte I(Ca) Modulation, waren beobachteten folgende Beleuchtung von Neuronen ausdrückt, FL-BTX-gekennzeichnet Natrium-Kanal-beta2-Untereinheiten oder ionotrope 5-HT(3) Rezeptoren, Proteine ohne offene Beziehung zu GPCR Signalisierung Wege. Zweitens war GPCR-unabhängige I(Ca) Modulation mit intrazellulären Guanylatzyklase Imidophosphate induziert auch von FALI abgeschwächt. Diese Daten fordern die Annahme, dass das Protein Fluorophor markiert das alleinige Ziel von FALI und nachweisen, dass Kollateralschäden an proximalen Proteine nach Fluorophor Beleuchtung stattfindet.

Kalzium-Kanäle Ihrer Signalisierung Portfolio Zu Diversifizieren

Nature Neuroscience. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17318216

Schätzung Von Protein-Protein Interaktion Affinität in Lebenden Zellen Mit Quantitative Förster Resonanz Energie Transfer Messungen

Journal of Biomedical Optics. Sep-Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17994899

Wir haben bereits bewiesen, dass Forster Resonanz Energie Transfer (FRET) Effizienz und die relative Konzentration des Spenders und Akzeptor Fluorophore in lebenden Zellen mit drei-Cube Wide-Field-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden kann. Hier erweitern wir die Methodik, um die effektive Dissoziation Gleichgewichtskonstante (Kd) und die systeminterne FRET-Effizienz (Emax) ein zusammenwirkendes Donor-Akzeptor-Paars zu schätzen. Angenommen, bimolekular Interaktion, ist die vorhergesagte FRET-Effizienz eine Funktion des Spenders Konzentration, Akzeptor Konzentration, Kd und Emax. Wir schätzen Kd und Emax durch Minimierung der Summe der quadrierten Fehler (SSE) zwischen der vorhergesagten und gemessenen FRET-Effizienz. Dies wird erreicht durch die Topologie der SSE-Werte für eine Matrix der hypothetischen Kd und Emax-Werte zu untersuchen. Anwenden eines F-Tests, die 95 % Konfidenz-Kontur des Kd und Emax berechnet. Wir testen die Methode zum Ausdruck bringen, ein durch Induktion FRET-Fusion-Paar, bestehend aus FKBP12-Cerulean und Frb-Venus in HeLa-Zellen. Wie der Kd für FKBP12-angiomiolipomas und Frb analytisch bestimmt wurde, konnte die relative Kd (in Fluoreszenz-Einheiten) mit einem Wert auf der Grundlage von Protein-Konzentration kalibriert werden. Die beschriebene Methodik sollte für den Vergleich von Protein-Protein Interaktion Affinitäten in lebenden Zellen nützlich sein.

N-Arachidonoyl L-Serin, Ein Mutmaßliches Endocannabinoid, ändert Die Aktivierung N-Typ Ca2 +-Kanäle in Den Sympathischen Neuronen

Journal of Neurophysiology. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18234973

Die Wirkung von N-Arachidonoyl l-Serin (ARA-S), einer vor kurzem entdeckten Lipoamino-Säure im ZNS, N-Typ Ca2 + Kanäle der Ratte sympathischen Ganglion Neuronen gefunden wurde mit der ganzen Zelle Patch Clamp ermittelt. Anwendung der ARA-S produziert eine rasche und reversibel Vermehrung des Ca2 + Strom, die Spannung abhängige und resultierte aus einer hyperpolarizing Verschiebung in der Aktivierungs-Kurve war. ARA-S hatten keinen Einfluss auf G-Protein-Modulation der Ca2 +-Kanäle und unabhängig von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren erschien. Diese Erkenntnisse bieten eine Grundlage für die Untersuchung von möglichen Rollen für ARA-S im Nervensystem-Funktion.

Eigenschaften Der Wildtyp Und Fluoreszierende Protein-Tag Maus Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanal (Na V 1.8) Heterologously in Ratte Sympathischen Neuronen Exprimiert

Journal of Neurophysiology. Apr, 2008  |  Pubmed ID: 18272876

Das Tetrodotoxin (TTX)-resistente Na(+) aktuelle entstehen, Na (V) 1.8-haltigen Kanäle beteiligt sich an nozizeptiven Bahnen aber ist schwierig mit traditionellen heterologen Systemen funktional ausgedrückt. Hier zeigen wir, dass die Injektion von cDNA Kodierung Maus Na (V) 1.8 in den Kernen der Ratte überlegener zervikaler Ganglion (SCG) Neuronen TTX-resistente Na(+) Strömungen mit Amplituden gleich oder überschreiten die Ströme aus nativ Ausdrücken Kanäle der Maus Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen führt. Die Aktivierung und Inaktivierung Eigenschaften der heterologously exprimierten Na (V) 1.8 Na(+) Kanäle waren ähnlich, aber nicht identisch mit native TTX-resistenten Kanäle. Vor allem wurde das Hälfte-Aktivierung-Potenzial der heterologously exprimierten Na (V) 1.8 Kanäle verschoben etwa 10 mV in Richtung mehr erschütterten Potenziale. Fusion von fluoreszierende Proteine zu den N - oder C-Termini der Na (V) 1.8 funktionalen Ausdruck in SCG Neuronen nicht wesentlich beeinträchtigen. Unerwartet, Fluoreszenz konzentrierte sich nicht an die Plasmamembran aber im gesamten Innenraum des Neurons in einem körnigen Muster gefunden. Ein ähnliches Ausdrucksmuster wurde in dass Ganglion Neuronen Ausdrücken die markierte Kanäle beobachtet. Im Gegensatz dazu offenbart Ausdruck der gekennzeichneten Na (V), 1,8 HeLa-Zellen eine Fluoreszenz-Muster mit Sequestrierung in Endoplasmatisches Reticulum, wodurch eine Grundlage für arme funktionaler Ausdruck in klonalen Zelllinien. Unsere Ergebnisse etablieren SCG Neuronen als günstigen Ersatz für den Ausdruck und die Studie der Molekular definierter Na (V) 1.8-haltigen Kanäle. Die Daten zeigen auch, dass nicht identifizierte Faktoren verlangt für die effiziente funktionaler Ausdruck von Na (V) 1.8 mit einem biophysikalischen Phänotyp identisch mit dem in sensorischen Neuronen gefunden werden können.

Ermittlung Der Spezifischen Regulatorischen Region Sensorischen Neuron Für Maus Gen, Das Den Spannung-Gating Natriumkanal NaV1.8

Journal of Neurochemistry. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18466327

Spannung-Gating Natrium-Kanäle (VGSC) sind kritische Membran-Komponenten, die die elektrische Aktivität der excitable Zellen teilnehmen. Die Typ-1-VGSC-Familie umfasst die Tetrodotoxin unempfindlich Natriumkanal, Na (V) 1.8, die Scn10a-Gen codiert. Na (V) 1.8 Ausdruck beschränkt sich auf kleine und mittlere Durchmesser nozizeptive sensorische Neuronen der Spinalganglien und kraniale sensorische Ganglien. Um die strengen transkriptionelle Regulation des Scn10a-Gens zu verstehen, wurde der sensorischen Neuron spezifische Projektträger funktionell identifiziert. Beim Identifizieren von mRNA 5'-Ende, wurde alternatives Spleißen innerhalb der 5'-UTR beobachtet, Heterogenität in der RNA-Abschrift zu erstellen. Vier Kilobases upstream genomischer DNA geklont wurde, und das Vorhandensein von Gewebe-spezifische Promotor-Aktivität durch Mikroinjektion und adenoviral Infektion fluoreszierenden Proteins Reporter Konstrukte in primären Maus und Ratte Neuronen und Zelllinien getestet wurde. Der Bereich enthalten viele vermeintliche Transkription Faktor-Bindungsstellen und starke Homologie mit den vorhergesagten Ratte-Ortholog. Homologie zu den vorhergesagten menschlichen Ortholog beschränkte sich das proximale Ende und mehrere konservierte Cis-Elemente festgestellt wurden. Zwei regulatorischen Module wurden durch Mikroinjektion von Reporter-Konstrukten in Spinalganglien und überlegener zervikaler Ganglien Neuronen identifiziert: ein Neuron-spezifische proximale Promotor-Region zwischen 1,6 und 0,2 kb der Transkription beginnen, Website-Cluster und in einer distalen sensorischen Neuron-Switch-Region über 1,6 kb, die fluoreszierenden Proteinausdruck auf eine Teilmenge der primären sensorischen Neuronen eingeschränkt.

Eine Punktmutation an Galphai Blockiert Selektiv GoLoco Motiv Bindung: Direkte Beweise Für Galpha.GoLoco-komplexen in Mitotische Spindel Dynamik

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18984596

Heterotrimeres G-Protein-Galpha-Untereinheiten und GoLoco Motiv Proteine sind wichtige Elemente einer konservierten Menge regulatorische Proteine, die Wirbellosen asymmetrische Zellteilung und vertebrate Neuroepithelium und epithelialen Vorläuferzellen Differenzierung beeinflussen. GoLoco Motiv Proteine binden selektiv an der hemmenden Unterklasse (Galphai) des Galpha Untereinheiten und damit es wird angenommen, dass ein Galphai.GoLoco Motiv Proteinkomplex eine direkte funktionelle Rolle Microtubule Dynamik zugrunde liegende spielt Spindel Orientierung und Metaphase chromosomalen Segregation während der Zellteilung. Um diese Hypothese zu beheben haben wir direkt, rational eine Punktmutation an Galphai Untereinheiten, die eine selektive Verlustfunktion für GoLoco Motiv Bindung, nämlich ein Asparagin-Isoleucin-Substitution in der Schleife AlphaD-AlphaE von der Galpha-Kegelrad-Domäne rendert. Diese Mutation GoLoco-Insensitivität ("GLi") verhindert Galphai1 Verband mit allen menschlichen GoLoco Motiv Proteine und aufgehobene Interaktion zwischen der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans Galpha Untereinheit GOA-1 und das GPR-1 GoLoco-Motiv. Im Gegensatz dazu die GLi-Mutation nicht andere biochemischen oder Signalisierung Eigenschaften der Galphai-Untereinheiten, einschließlich Nukleotid-Bindung, systeminterne RGS Protein-beschleunigte GTP Hydrolyse und Interaktionen mit Gbetagamma Dimer Fehlfunktion Guanylatcyclase und sieben Transmembranegebiet Rezeptoren verlängern. GoLoco Unempfindlichkeit wiedergegeben Galphai-Untereinheiten, die nicht in der Lage GoLoco Motiv Proteine wie GPSM2/LGN und GPSM3 an der Plasmamembran zu rekrutieren und aufgehoben, das übertriebene mitotische Spindel Schaukeln auf ektopische Expression Wildtyp-Galphai-Untereinheiten in Epithelzellen der Niere normalerweise gesehen. GLi Mutation sollte beweisen wertvoll bei der Festlegung der physiologischen Rollen von Galphai.GoLoco Motiv Proteinkomplexen Microtubule Dynamik und Funktion der Spindel während der Zellteilung sowie um mögliche Rollen für GoLoco Motive in Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion voneinander abzugrenzen.

Hemmung Der N-Typ-Kalzium-Kanäle Durch Die Aktivierung Des GPR35, Ein Verwaistes Rezeptor, Heterologously in Ratte Sympathischen Neuronen Exprimiert

The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17940199

GPR35 ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor kürzlich "de-orphanized" mit hohem Durchsatz intrazelluläre Kalzium Messungen in klonalen Zelllinien, die Ausdruck einer Chimären G-Protein Alpha-Untereinheit. Ausgehend von diesen Masken, Kynurenic Säure, entstand eine endogene Metabolit von Tryptophan und Zaprinast, ein synthetisches Inhibitor der zyklischen Guanosinmonophosphat-spezifischen Phosphodiesterase, als potenzielle Agonisten für GPR35. Um die Kupplung des GPR35 nativ exprimierten neuronale Signalwege und Effektoren zu untersuchen, wir heterologously GPR35 in Ratte sympathischen Neuronen exprimiert und untersucht die Beeinflussung der N-Typ (Ca(V)2.2)-Kalzium-Kanäle. In Neuronen, die GPR35 zum Ausdruck zu bringen wurden Kalzium-Kanäle ohne offenkundige Agonisten, angibt, eine Tonikum-Rezeptor-Aktivität gehemmt. Anwendung der Kynurenic Säure oder Zaprinast führte robuste Spannung-abhängige Kalzium aktuelle Hemmung charakteristisch für Gbetagamma-vermittelten Modulation. Sowohl Agonisten-unabhängige und -abhängige Effekte des GPR35 wurden von Bordetella Pertussis-Toxin Vorbehandlung angibt, die Einbeziehung der G(i/o) Proteine blockiert. In Neuronen Ausdrücken GPR35a, eine kurze Spleiß-Variante des GPR35, wurde Zaprinast potenter (EC(50) = 1 MicroM) als Kynurenic Säure (58 MicroM) hatte aber eine ähnliche Wirksamkeit (ca. 60 % maximale Kalzium aktuelle Hemmung). Ausdruck von GPR35b, die eine zusätzliche 31 Rückstände im N-Terminus, produzierte ähnliche Ergebnisse, aber mit viel größere Variabilität hat. Sowohl die GPR35a als auch die GPR35b schien ähnlich Ausdrucksmuster wenn fluoreszierende Proteine verschmolzen haben. Diese Resultate schlagen eine mögliche Rolle für GPR35 bei der Regulierung der neuronalen Erregbarkeit und synaptische Freigabe.

Schnelle Änderung Der Proteine, Die Mit Einen Angiomiolipomas-inducible Tabak Etch-Virus-Protease-System

PloS One. 2009  |  Pubmed ID: 19830250

Die Fähigkeit, die Funktion eines bestimmten Proteins auf einer schnellen Zeitskala zu stören ist ein leistungsstarkes Tool für die biomedizinische Forschung. Spezifische Proteasen stellen eine mögliche Methode um eine gewählte Protein selektiv zu Zerspalten, schnelle Kontrolle der Protease-Aktivität ist jedoch schwierig.

Molekulare Rekonstruktion Des MGluR5a-vermittelte Endocannabinoid Signalling Kaskade in Einzelne Ratte Sympathischen Neuronen

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19864572

Endocannabinoide (EZB) wie 2-Arachidonylglyzerol (2-AG) sind Lipid Stoffwechselprodukte, die in ein postsynaptisches Neuronen synthetisiert und danach handeln CB1 Cannabinoid-Rezeptoren (CB(1)R) in präsynaptischen Nervenenden. Diese retrograde Übertragung zugrunde liegt, verschiedene Formen von kurzen und langen Begriff synaptische Plastizität im CNS. Hier errichteten wir ein Modell-System basierend auf isolierte Ratte sympathischen Neuronen, in denen eine EZB Signalisierung Kaskade in einem reduzierten, räumlich kompakt und genetisch Klemmverbinder System untersucht werden konnte. Durch fortlaufende Zugabe von molekularen Bestandteilen konstruierten wir einen kompletten EZB Produktion/Mobilisierung Weg. Heterologe Expression von vier Komponenten war bei der EZB-Produktion und -Erkennung: Metabotropic Glutamate Rezeptor 5a (mGluR5a), Homer, 2b, Diacylglycerol Lipase Alpha und CB (1) R. In diese Neuronen produziert Anwendung von l-Glutamat in schnelle enzymatische Produktion von 2-AG, gefolgt von der Aktivierung des CB (1) R. Spannung-abhängigen Modulation der Ca(2+) N-Typ-Kanäle vermittelt durch Aktivierung des CB (1) R. mit molekularen Dissektion und pharmakologische Agenten, wir die Aktivierung des mGluR5a Ergebnisse nachweisen Diese Experimente definieren die kritischen Elemente benötigt, um die retrograde EZB Produktions- und signalisieren in ein einzelnes periphere Neuron zu rekapitulieren. Produktion/Mobilisierung der EZB können darüber hinaus auf eine physiologisch relevante Zeitskala mit elektrophysiologische Methoden nachgewiesen werden. Das System bietet eine Plattform für die Prüfung der Kandidaten-Moleküle, die Erleichterung der EZB-Transport über die Plasmamembran zugrunde.

Eine Einfache, Effiziente Methode Für Heterologe Expression in Säugetieren Primäre Neuronen Mit Kationischen Lipid-mediated MRNA Transfektion

Frontiers in Neuroscience. 2010  |  Pubmed ID: 21267423

Ausdruck von heterologen Proteinen in Erwachsenen Säugetier-Neuronen ist eine wertvolle Technik zur Erforschung der neuronalen Funktion. Die post-mitotic Art der Reife Neuronen verhindert effektiv mit einfache, kationische Lipid-basierte Methoden DNATransfection. Angemessene heterologe Proteinexpression ist oft nur mit komplexe Techniken, die in vielen Fällen erhebliche Toxizität zugeordnet sind. Hier transkribiert eine einfache Methode für hocheffiziente Transfection Säugetier-primäre Neuronen, die mithilfe von in-vitro-mRNA und die kationischen Lipid-Transfektionsreagenz beschriebenen Lipofectamine ™ 2000. Optimale Transfektion Bedingungen wurden in adulten Maus dissoziiert Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen mit einer 96-Well basierend Luciferase-Aktivitätstest gegründet. Verwenden diese Bedingungen, eine Transfektionseffizienz von 25 % in DRG-Neuronen, die mit EGFP mRNA transfected erzielt. Hohe Transfektion Effizienz wurden auch in getrennten Ratte überlegener zervikaler Ganglion (SCG) Neuronen und Maus kortikale und hippocampal Kulturen erzielt. Endogene Ca(2+) Strömungen in EGFP mRNA-transfected SCG Neuronen waren nicht wesentlich anders als untransfected Neuronen, die vorgeschlagen hat, dass diese Technik gut geeignet für heterologe Expression in Patch-Clamp-Experimenten Aufnahme. Funktionaler Ausdruck ein Cannabinoid-Rezeptor (CB1R), ein G-Protein, das innerlich Rektifizieren K(+) Channel (GIRK4) und eine Dominant-negativen G Protein α-Untereinheit Mutante (G(oA) G203T) zufolge sind die heterologe Proteinexpression erreichbar mit mRNA Transfektion geeignet für die meisten Funktionsstudien Protein. Diese Studie zeigt, dass die mRNA Transfektion ist eine einfache und effektive Methode für heterologe Expression in Neuronen und dürfte viele Anwendungen in der Neurologie Forschung haben.

Identifizierung Und Modulation Der Spannung-Gating Ca2 + Strömungen Im Zebrafisch Rohon-Bart Neuronen

Journal of Neurophysiology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20962070

Elektrisch erregbar Zellen haben Spannung-abhängigen Ionenkanäle auf der Plasmamembran, die Durchlässigkeit der Membran für bestimmte Ionen regulieren. Spannung-Gating Ca(2+) Kanäle (VGCCs) sind besonders wichtig, da Ca(2+) Da beide ein kostenlos Carrier und zweite Bote dient. Zebrabärbling (Danio Rerio) sind ein wichtiges Modell für Studien über neuronale Erregbarkeit, Schaltungen und Verhalten Wirbeltiere. Elektrophysiologische Eigenschaften des Zebrafish VGCCs bleiben jedoch weitgehend unerforscht, weil eine geeignete Aufbereitung für die gesamte Zelle Spannung Klemm-Studien fehlt. Rohon-Bart (R-B) sensorische Neuronen stellen einen attraktiven Kandidaten für diesen Zweck aufgrund ihrer relativ großen Somata und funktionelle Homologie zu Säugetier-Spinalganglien Ganglien (DRG) Neuronen dar. Transgene Zebrafisch Ausdrücken grünes fluoreszierendes Protein in R-B-Neuronen, (Isl2b:EGFP)(ZC7), wurden zur getrennten Neuronen geeignet für ganze Zelle Patch-Clamp-Experimenten zu identifizieren. Basierend auf biophysikalischen und pharmakologische Eigenschaften, Zebrafish R-B Neuronen schnelles beide hoch - und niedrig-Spannung-Gating Ca(2+) Strom (HVA- und LVA-I(Ca), beziehungsweise). NI (+)-sensible LVA-I(Ca) auftreten, in der Minderheit von R-B-Neuronen (30 %) und ω-Conotoxin GVIA-Sensitive-Ca (V) 2.2 (N-Typ) Ca(2+) Kanäle zugrunde liegen, die überwiegende Mehrheit (90 %) des HVA-I(Ca). Um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu identifizieren, die HVA-I(Ca) zu modulieren, wurde ein Gremium von Neurotransmittern gezeigt. Anwendung von GABA/Baclofen oder Serotonin produziert eine Spannung-abhängigen Hemmung während der Anwendung von den Mu-Opioid-Agonisten, die, den DAMGO eine Hemmung der Spannung unabhängig geführt. Im Gegensatz zu scheint GPCR-vermittelte Spannung-abhängigen Modulation des I(Ca) in den Säugetier-Neuronen, in erster Linie über eine Cholera-Toxin-Sensitive Gα-Untereinheit ausgestrahlt werden. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für die Verwendung der Zebrafisch-Modellsystem für das Verständnis Ca(2+)-Kanal-Funktion, und im Gegenzug wie Ca(2+) Kanäle zur Mechanosensory-Funktion.