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Articles by Tomislav Maricic in JoVE
JoVE General
Primer captura Extensión: Secuencia de recuperación selectiva de las fuentes de ADN muy degradado
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
Se presenta un método de recuperación de antiguos dirigidos secuencia de ADN, que se utiliza para reconstruir el genoma mitocondrial completo de cinco individuos neandertales. La comparación de estas secuencias con los seres humanos actuales sugieren que los neandertales tenían una baja capacidad a largo plazo efectivo de la población.
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De Microgramos a Picogramos: PCR Cuantitativa Reduce Las Demandas Materiales De Secuenciación De Alto Rendimiento
Los esfuerzos actuales para recuperar el Neandertal y el mamuts genomas por 454 secuenciación de ADN demuestran la sensibilidad de esta tecnología. Sin embargo, aplicaciones de secuenciación de rutina 454 todavía requieren cantidades de microgramos de material inicial. Esto es debido a la falta de métodos eficaces para cuantificación 454 secuenciación bibliotecas, que requiere procedimientos costosos y mano de obra cuando la secuenciación de ADN antiguo y otras muestras de ADN de pobres. Presentamos un método de cuantificación de biblioteca de 454 secuenciación basado en la PCR cuantitativa que elimina eficazmente estas limitaciones. Estimamos tanto los números de la molécula y las distribuciones de tamaño de fragmento en bibliotecas de secuenciación derivadas de extractos de ADN del Neandertal, SAGE ditags y el ADN genómico de bonobo, obtener rendimientos óptimos de la secuencia sin realizar cualquier valoración carreras. Usando este método, las secuencia 454 rutinariamente se puede realizar desde tan poco como 50 pg de material inicial sin titulación carreras, reduciendo así drásticamente costos aumentando el alcance del desarrollo de la velocidad de transmisión y Protocolo de la muestra en la plataforma 454. El método también debería aplicarse a Illumina/Solexa y secuenciación de ABI/sólido y por lo tanto contribuirá a ampliar la accesibilidad de las tres plataformas.
Un Neandertal Completa Secuencia Del Genoma Mitocondrial Determinado Por Secuenciación De Alto Rendimiento
Una secuencia del genoma mitocondrial completo (mt) fue reconstruida de un Neandertal de años 38.000 individuales con 8341 secuencias de mtDNA entre 4,8 Gb de ADN generado a partir de aproximadamente 0,3 g de hueso. Análisis de la secuencia montado establece inequívocamente que el Neandertal mtDNA cae fuera de la variación de mtDNAs humanos existentes y permite una estimación de la fecha de divergencia entre los dos linajes de mtDNA de 660.000 +/-140.000 años. De las 13 proteínas codificadas en el ADNmt, subunidad 2 de citocromo c oxidasa de la cadena de transporte de electrones mitocondrial ha experimentado el mayor número de sustituciones de aminoácidos en los antepasados humanos desde la separación de los neandertales. Existen evidencias que purificar la selección en el Neandertal mtDNA se redujo en comparación con otros linajes de primates, lo que sugiere que el tamaño efectivo de población de neandertales era pequeño.
Optimización De 454 Secuenciación De Preparación De La Biblioteca De Pequeñas Cantidades De ADN Permite La Determinación De La Secuencia De Dos Filamentos De La DNA
Para aumentar el rendimiento de la secuencia de la DNA generado por la tecnología 454 de pequeñas cantidades de a partir de ADN, investigamos la eficacia de cada paso en el proceso de preparación de la 454 biblioteca. Encontramos que el último paso, cuando la biblioteca monocatenario se publica por NaOH, es ineficiente y altamente variable. Si este paso se sustituye con el tratamiento térmico, cantidades de biblioteca aumentan dramáticamente. Además, cuando la secuencia plantillas primero son aisladas por tratamiento de NaOH y posteriormente por tratamiento térmico, se pueden determinar las secuencias de las dos líneas de las moléculas de ADN de cada plantilla. Usando esta aproximación, confirmamos que pares de base C/G observó como T / A pares de base en secuencias de ADN de Neandertal son debido a una modificación de los residuos de citosina en lugar de guanina.
Recuperación Específico Y Análisis De Genomas De MtDNA De Neandertal Cinco
Análisis de ADN del Neandertal tiene gran potencial para la investigación de la historia de la población de este grupo de homínidos, pero el progreso ha sido limitado debido a la rareza de las muestras y estado dañado de la DNA. Presentamos un método de específica antigua recuperación de secuencia de ADN que reduce la destrucción de la muestra y la secuenciación de las demandas y utiliza este método para reconstruir los genomas completos de ADN (mtDNA) mitocondriales de cinco neandertales de a través de su área de distribución geográfica. Encontramos que la diversidad genética del mtDNA en neandertales que vivieron hace de 38.000 a 70.000 años era aproximadamente un tercio de los en los seres humanos modernos contemporáneos. Junto con el análisis de la evolución de proteínas mtDNA, estos datos sugieren que el tamaño efectivo de población a largo plazo de los neandertales era menor que la de los seres humanos modernos y los grandes simios.
Un Genoma Completo Del MtDNA De Un Humano Moderno Temprano De Kostenki, Rusia
La recuperación de secuencias de ADN de los seres humanos modernos tempranos (EMHs) podría arrojar luz sobre sus interacciones con grupos arcaicos como neandertales y sus relaciones con las poblaciones humanas actuales. Sin embargo, tales experimentos son altamente problemáticos ya que ADN humano actual contamina con frecuencia huesos [1, 2]. Por ejemplo, en un reciente estudio de (mt) ADN mitocondrial del neolíticos europeos esqueletos, secuencia variantes sólo fueron tomadas como auténticas si fueran ausentes o raro en la población actual, mientras que otros tuvieron que ser descontados como posible contaminación [3, 4]. Esto limita el análisis a individuos EMH portadores de secuencias raras y así produce una visión sesgada de la antigua piscina de gene. Otros enfoques de identificar contaminando el ADN, como el genotipado de todas las personas que han entrado en con con una muestra, restringen el análisis a muestras donde esto es posible [5, 6] y no excluyen todas las posibles fuentes de contaminación. Mediante el estudio de ADNmt en restos de Neandertal, donde la contaminación y el ADN endógeno pueden distinguirse por secuencia, demostramos que los patrones de fragmentación y misincorporations nucleótido pueden utilizarse para medir la autenticidad de las secuencias de ADN antiguas. Utilizamos estas características para determinar una secuencia completa de mtDNA de una EMH aproximadamente 30.000 años desde el sitio de Kostenki 14 en Rusia.
Un Esbozo De La Secuencia Del Genoma Del Neandertal
Los neandertales, los parientes evolutivos más cercanos de los humanos actuales, vivían en grandes partes de Europa y Asia occidental antes de desaparecer hace 30.000 años. Se presenta un proyecto de secuencia del genoma del Neandertal compuesta por más de 4 mil millones de nucleótidos de tres individuos. Las comparaciones del genoma del Neandertal con los genomas de cinco humanos actuales de diferentes partes del mundo, identificar una serie de regiones genómicas que pueden haber sido afectados por la selección positiva en los ancestrales los seres humanos modernos, incluidos los genes implicados en el metabolismo y en el desarrollo cognitivo y del esqueleto . Se demuestra que los neandertales comparten variantes genéticas con más de hoy en día los seres humanos en Eurasia que con los actuales seres humanos en el África subsahariana, lo que sugiere que el flujo genético de los neandertales a los ancestros de los no africanos se produjo antes de la divergencia de los grupos euroasiáticos entre sí .
Investigación Dirigida Del Genoma Neandertal Por Captura De Secuencia Basada En Arreglos
Ahora es posible realizar la secuenciación del genoma completo de escopeta, así como captura de regiones genómicas específicas de los organismos extintos. Sin embargo, resecuenciación específicas de las partes grandes de genomas nucleares todavía debe demostrarse para ADN antiguo. Aquí mostramos que captura de hibridación de microarrays podrá recuperar con éxito más de una megabase de regiones objetivo de ADN Neandertal incluso en presencia de aproximadamente 99,8% de ADN microbiano. Usando esta aproximación, hemos secuenciado aproximadamente 14.000 proteína-codificación posiciones deducidos a han cambiado en el linaje humano desde el último antepasado común compartido con los chimpancés. Mediante la generación de la secuencia de un Neandertal y 50 seres humanos actuales en estas posiciones, hemos identificado 88 sustituciones de aminoácidos que se fijan en los seres humanos desde nuestra divergencia de los neandertales.
Historia Genética De Un Grupo De Homínidos Arcaicos De La Cueva De Denisova, En Siberia
Utilizando el ADN extraído de un hueso del dedo encontrado en la cueva de Denisova en Siberia del sur, hemos secuenciado el genoma de un homínido arcaico a unos 1.9-fold de cobertura. Este individuo es parte de un grupo que comparte un origen común con los neandertales. Esta población no estaba involucrada en el flujo de genes putativo de los neandertales en euroasiáticos; sin embargo, los datos sugieren que contribuyó 4-6% de su material genético a los genomas de los melanesios actuales. Nos designar a esta población de homínidos "Denisovans" y sugieren que puede haber sido extendido en Asia durante la época del Pleistoceno tardío. Un diente encontrado en la cueva de Denisova lleva un genoma mitocondrial muy similar a la del hueso del dedo. Este diente no comparte características morfológicas derivadas con los neandertales o los seres humanos modernos, indicando además que Denisovans tienen una historia evolutiva distinta de los neandertales y los humanos modernos.
Secuencia De ADN Multiplexado Captura De Genomas Mitocondriales Usando Productos PCR
Para utilizar el poder de los secuenciadores de alto rendimiento, se han desarrollado métodos de enriquecimiento del destino. La mayoría de ellos requiere reactivos y equipos que sólo están disponibles de proveedores comerciales y no es adecuada para los objetivos que son unos kilobases en longitud.
