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Articles by Udo Stenzel in JoVE
JoVE General
Primer captura Extensión: Secuencia de recuperación selectiva de las fuentes de ADN muy degradado
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
Se presenta un método de recuperación de antiguos dirigidos secuencia de ADN, que se utiliza para reconstruir el genoma mitocondrial completo de cinco individuos neandertales. La comparación de estas secuencias con los seres humanos actuales sugieren que los neandertales tenían una baja capacidad a largo plazo efectivo de la población.
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Secuenciación De Alto Rendimiento Específico De Muestras De ácido Nucleico Etiquetado
Tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento 454 permite mucho más rápida y más rentable de secuenciación de Sanger tradicional de la secuencia. Sin embargo, la tecnología impone limitaciones inherentes en el número de muestras que se pueden procesar en paralelo. Aquí presentamos secuenciación etiquetado en paralelo (PTS), una técnica de código de barras simple, barata y flexible que se puede utilizar para ordenar cualquier número y tipo de muestras de ácido nucleico de doble cadena en paralelo. Demostramos que PTS es particularmente de gran alcance para la secuenciación de fragmentos de ADN contiguos como mtDNA genomas: en teoría hasta 250 genomas de mamíferos mtDNA pueden ser ordenados en una sola GS FLX ejecutar. PTS aumenta drásticamente el rendimiento de la secuenciación de muestras en paralelo y así totalmente moviliza los recursos de la tecnología 454 para apuntada de secuenciación.
Patrones De Daño Genómico Secuencias De ADN De Un Neandertal
Técnicas de secuenciación directa de alto rendimiento han abierto recientemente la posibilidad de secuenciar genomas de organismos Pleistocenos. Aquí analizamos las secuencias de ADN determinadas un Neandertal, un mamut y un oso de las cavernas. Demostramos que los purines son representados en posiciones adyacentes a las roturas en el ADN antiguo, sugiriendo que depurinación ha contribuido a su degradación. Además, mostramos que sustituciones resultantes de un residuos de citosina son enormemente en las secuencias de ADN y drásticamente agrupadas en los extremos de las moléculas, mientras que otras sustituciones son raras. Presentamos un modelo donde los patrones observados de sustitución se utilizan para estimar la tasa de desaminación de residuos de citosina en porciones de la solo - y double-stranded de la DNA, la longitud de los extremos monocatenario y la frecuencia de nicks. Los resultados sugieren que las secuencias del genoma confiable pueden obtenerse organismos Pleistocenos.
Paralelamente La Secuencia Etiquetada En La Plataforma 454
Secuenciación etiquetado en paralelo (PTS) es un método de código de barras molecular diseñado para adaptarse a la tecnología de 454 secuenciación en paralelo de alto rendimiento recientemente desarrollada para su uso con múltiples muestras. A diferencia de otros métodos de código de barras, PTS puede aplicarse a cualquier tipo de muestra de ADN (dsDNA) bicatenario, incluyendo bibliotecas de ADN de escopeta y piscinas de los productos PCR y no requiere ninguna amplificación o gel pasos de purificación. El método se basa en colocar adaptadores específicos muestra código de barras, que incluyen etiquetas de secuencia y un sitio de la restricción, blunt-fin reparada muestras de ADN por la ligadura y el filamento-desplazamiento. Después de reunir múltiples muestras de código de barras, moléculas sin etiquetas de secuencia efectivamente están excluidas la secuencia por la desfosforilación y restricción de la digestión, y usando las secuencias de la etiqueta, la fuente de cada secuencia de ADN puede rastrearse. Este protocolo permite secuenciación de genomas mitocondriales 300 o más completas en un solo 454 GS FLX ejecutan o secuencias de 6 kb plásmido veinticinco sólo uno 16 placa región. La mayoría de las reacciones se puede realizar en una instalación multicanal en placas de 96 pocillos de reacción, permitiendo para procesar hasta varios centenares de muestras en unos días.
PatMaN: Rápido Alineamiento De Secuencias Cortas Para Grandes Bases De Datos
Presentamos una herramienta adecuada para buscar muchas secuencias de nucleótidos cortas en grandes bases de datos, permitiendo un número predefinido de lagunas y desajustes. El programa impulsado por línea de comandos implementa una coincidencia de algoritmo en un árbol de la palabra clave de las cadenas de búsqueda no determinista de autómatas. Ambas consultas con y sin códigos de ambigüedad pueden ser buscadas. Tiempo de búsqueda es la abreviatura de partidos perfectos, y tiempo de recuperación aumenta exponencialmente con el número de ediciones permitido. DISPONIBILIDAD: El código fuente de C++ para PatMaN se distribuye bajo la Licencia Pública General de GNU y se ha probado en el sistema operativo GNU/Linux. Está disponible desde http://bioinf.eva.mpg.de/patman. INFORMACIÓN complementaria: Datos complementarios están disponibles en Bioinformática en línea.
Un Neandertal Completa Secuencia Del Genoma Mitocondrial Determinado Por Secuenciación De Alto Rendimiento
Una secuencia del genoma mitocondrial completo (mt) fue reconstruida de un Neandertal de años 38.000 individuales con 8341 secuencias de mtDNA entre 4,8 Gb de ADN generado a partir de aproximadamente 0,3 g de hueso. Análisis de la secuencia montado establece inequívocamente que el Neandertal mtDNA cae fuera de la variación de mtDNAs humanos existentes y permite una estimación de la fecha de divergencia entre los dos linajes de mtDNA de 660.000 +/-140.000 años. De las 13 proteínas codificadas en el ADNmt, subunidad 2 de citocromo c oxidasa de la cadena de transporte de electrones mitocondrial ha experimentado el mayor número de sustituciones de aminoácidos en los antepasados humanos desde la separación de los neandertales. Existen evidencias que purificar la selección en el Neandertal mtDNA se redujo en comparación con otros linajes de primates, lo que sugiere que el tamaño efectivo de población de neandertales era pequeño.
Recuperación Específico Y Análisis De Genomas De MtDNA De Neandertal Cinco
Análisis de ADN del Neandertal tiene gran potencial para la investigación de la historia de la población de este grupo de homínidos, pero el progreso ha sido limitado debido a la rareza de las muestras y estado dañado de la DNA. Presentamos un método de específica antigua recuperación de secuencia de ADN que reduce la destrucción de la muestra y la secuenciación de las demandas y utiliza este método para reconstruir los genomas completos de ADN (mtDNA) mitocondriales de cinco neandertales de a través de su área de distribución geográfica. Encontramos que la diversidad genética del mtDNA en neandertales que vivieron hace de 38.000 a 70.000 años era aproximadamente un tercio de los en los seres humanos modernos contemporáneos. Junto con el análisis de la evolución de proteínas mtDNA, estos datos sugieren que el tamaño efectivo de población a largo plazo de los neandertales era menor que la de los seres humanos modernos y los grandes simios.
Secuencia Múltiplex Directa (DMPS)--un Novedoso Método De Secuenciación De Alto Rendimiento Específico De ADN Antiguo Y Muy Degradada
Aunque la aparición de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha permitido la secuenciación del genoma completo de organismos extintos, pequeños progresos en acelerar la secuencia específica de ADN altamente degradado. Aquí, presentamos un método novedoso y altamente sensible para específica secuenciación del ADN antiguo y degradado, que las parejas multiplexan PCR directamente con código de barras muestra y secuenciación de alto rendimiento. Usando esta aproximación, obtuvimos un conjunto de datos del genoma mitocondrial completo de 96% de 31 oso de las cavernas (Ursus spelaeus) muestras utilizando sólo dos 454 Life Sciences (Roche) GS FLX funciona. A diferencia de estudios anteriores confiando sólo en fragmentos de secuencia corta, la porción superpuesta de nuestros datos comprende casi 10 kb de secuencia del genoma mitocondrial replicados, permitiendo la diferenciación inequívoca de tres principales cueva oso clades. Nuestro método abre la oportunidad para generar simultáneamente muchos kilobases de datos superpuestos de la secuencia de grandes conjuntos de muestras difíciles, como especímenes de Museo, colecciones médicas o muestras forenses. Arraigada en nuestro enfoque, presentamos un nuevo protocolo para la construcción de código de barras las bibliotecas de la secuencia, que es compatible con todas las tecnologías actuales de alto rendimiento y puede realizarse enteramente en la configuración de la placa.
Mejorado Llamado Base Para El Analizador De Genoma Illumina Utilizando Estrategias De Aprendizaje De Máquina
El analizador de genoma Illumina genera millones de lecturas de secuenciación corto. Presentamos Ibis (Improved base identification system), una llamada base exacta, rápida y fácil de usar que significativamente reduce la tasa de error y aumenta la producción de Lee utilizable. Hotel ibis es más rápido y más sólido con respecto a la química y la tecnología que otros paquetes disponibles al público. El Ibis está libremente disponible bajo la GPL de http://bioinf.eva.mpg.de/Ibis/.
Retiro De Cytosines Deaminated Y Detección De Metilación En Vivo En ADN Antiguo
Secuencias de ADN determinadas organismos antiguos tienen tasas de error altas, debido principalmente a uracilo bases creadas por desaminación de la citosina. Utilizamos oligonucleótidos sintéticos, así como ADN extraído de mamut y restos de Neandertal, para mostrar que el tratamiento con uracil-DNA-glicosilasa y endonucleasa VIII elimina residuos de uracilo ADN antiguo y repara la mayoría de los sitios un resultantes, dejando intacto fragmentos de piezas del ADN intacto. Secuencias de ADN de Neandertal determinadas con este protocolo han aumentado grandemente la precisión. Además, nuestros resultados demuestran que ADN de Neandertal conserva vivo en patrones de metilación CpG, potencialmente permitiendo estudios futuros de inactivación del gen e imprimiendo en organismos antiguos.
Retos Computacionales En El Análisis De ADN Antiguo
Tecnologías de secuenciación de alto rendimiento han abierto una nueva vía para el estudio de organismos extintos. Aquí identificamos y cuantificar los sesgos introducidos por características particulares de las muestras de ADN antiguas. Estos análisis demuestran la importancia de la secuencia genómica estrechamente relacionada para correctamente identificar y clasificar bona fide fragmentos de ADN endógenos. Mostramos que estimaciones de divergencia más precisas del genoma de secuencia de ADN antiguo pueden lograrse utilizando al menos dos grupos genomas y filtrado adecuado.
Un Esbozo De La Secuencia Del Genoma Del Neandertal
Los neandertales, los parientes evolutivos más cercanos de los humanos actuales, vivían en grandes partes de Europa y Asia occidental antes de desaparecer hace 30.000 años. Se presenta un proyecto de secuencia del genoma del Neandertal compuesta por más de 4 mil millones de nucleótidos de tres individuos. Las comparaciones del genoma del Neandertal con los genomas de cinco humanos actuales de diferentes partes del mundo, identificar una serie de regiones genómicas que pueden haber sido afectados por la selección positiva en los ancestrales los seres humanos modernos, incluidos los genes implicados en el metabolismo y en el desarrollo cognitivo y del esqueleto . Se demuestra que los neandertales comparten variantes genéticas con más de hoy en día los seres humanos en Eurasia que con los actuales seres humanos en el África subsahariana, lo que sugiere que el flujo genético de los neandertales a los ancestros de los no africanos se produjo antes de la divergencia de los grupos euroasiáticos entre sí .
Bloqueos En Paleogenomes--perfiles De Extensión De Polimerasa Revela La Frecuencia De Lesiones En El ADN Antiguo De Bloqueo
Aunque los últimos años han visto grandes avances en la recuperación de la secuencia de ADN de muestras fósiles, algunas de las características de ADN antiguo siguen siendo mal entendidas. Esto es particularmente cierto para las lesiones bloquea, alteraciones químicas, es decir que no pueden evitarse por DNA polimerasas y evitar así la amplificación y posterior secuenciación de moléculas afectadas. Algunos estudios han concluido que la mayoría de las moléculas de ADN antiguas lleva bloquea lesiones, lo que sugiere que la remoción, reparación o derivación de bloquear las lesiones puede aumentar dramáticamente el tiempo profundidad y distribución geográfica de las muestras para análisis de ADN antiguo. Sin embargo, estudios anteriores utilizaron métodos de detección muy indirecta que no proporcionaron estimaciones concluyentes sobre la frecuencia de lesiones en el ADN antiguo endógena de bloqueo. Hemos desarrollado un nuevo método, la extensión de la polimerasa perfilado (PEP), que revela directamente las ocurrencias de estancamiento en las plantillas de la DNA de la polimerasa. Mediante la secuenciación de miles de productos de extensión de la cartilla única metodología PEP, tenemos para las lesiones bloqueo de primeras tiempo directamente identificado en ADN antiguo a nivel de un sola molécula. Aunque encontramos evidencia clara para bloquear las lesiones en tres de las cuatro muestras antiguas, no más del 40% de las moléculas se vieron afectado en ninguna de las muestras, lo que indica que dichas modificaciones son mucho menos frecuentes en ADN antiguo que se pensaba.
Historia Genética De Un Grupo De Homínidos Arcaicos De La Cueva De Denisova, En Siberia
Utilizando el ADN extraído de un hueso del dedo encontrado en la cueva de Denisova en Siberia del sur, hemos secuenciado el genoma de un homínido arcaico a unos 1.9-fold de cobertura. Este individuo es parte de un grupo que comparte un origen común con los neandertales. Esta población no estaba involucrada en el flujo de genes putativo de los neandertales en euroasiáticos; sin embargo, los datos sugieren que contribuyó 4-6% de su material genético a los genomas de los melanesios actuales. Nos designar a esta población de homínidos "Denisovans" y sugieren que puede haber sido extendido en Asia durante la época del Pleistoceno tardío. Un diente encontrado en la cueva de Denisova lleva un genoma mitocondrial muy similar a la del hueso del dedo. Este diente no comparte características morfológicas derivadas con los neandertales o los seres humanos modernos, indicando además que Denisovans tienen una historia evolutiva distinta de los neandertales y los humanos modernos.
