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Articles by Vladimir J. Kefalov in JoVE
JoVE Neuroscience
Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone
Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University School of Medicine
Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.
Other articles by Vladimir J. Kefalov on PubMed
Rompere Il Legame Covalente - Una Proprietà Di Pigmento Che Contribuisce Alla Desensibilizzazione Nei Coni
Pigmenti della retina rod e cono costituite da un'apoproteina, opsin, legato covalentemente a un cromoforo, 11-cis retinale. Qui dimostriamo che la formazione del legame covalente tra opsin e 11-cis retinale è reversibile nel buio in coni anfibio rosso, ma essenzialmente irreversibile nelle barre rosse. Questa dissociazione, apparentemente una proprietà generale di pigmenti cono, si traduce in una sorprendentemente grande quantità di opsin gratuito - circa il 10% del totale opsin - in dark-adapted coni rossi. Attribuiamo questo livello significativo di opsin gratis per la bassa concentrazione di intracellulare libero 11-cis retinale, stimato a essere solo una piccola frazione (circa 0,1%) il contenuto di pigmento rosso coni. Con la sua attività costitutiva transducina-stimolante, il opsin cono libero produce una desensibilizzazione circa 2 volte in rossi coni, equivalente a quello prodotto da una luce fissa causando 500 photoisomerizations s-1. Dissociazione di pigmento cono contribuisce quindi alla differenza di sensibilità tra coni e bastoncelli.
Proprietà Di Segnalazione Di Un Pigmento Visivo Cono Di Onda Corta E Il Suo Ruolo in Phototransduction
Sebbene visual pigmenti svolgono un ruolo chiave strutturale e funzionale in fotorecettori, il rapporto tra le proprietà dei pigmenti cono dei mammiferi e quelli dei mammiferi coni non è ben compreso. Abbiamo generato topi transgenici con canne esprimendo opsin di onda corta cono del mouse (S-opsin) per verificare se può sostituire i ruoli strutturali e funzionali della rodopsina pigmento cono e per indagare su come le proprietà biofisiche e segnalazione del pigmento cono di onda corta (S-pigmento) contribuiscono alla funzione specializzata del coni. La S-opsin transgenico è stato mirato a segmenti di canna esterna e formano un pigmento con assorbimento di picco a 360 nm. Espressione di S-opsin in canne privo di rodopsina (rho-/-) promosse la sopravvivenza delle cellule e la crescita di segmento esterno e ripristinata la loro capacità di rispondere alla luce mentre spostando il loro spettro di azione a 355 nm. Utilizzando la separazione spettrale tra S-pigmento e rodopsina, abbiamo scoperto che i due pigmenti prodotti simili photoresponses. Rumore scuro non aumenta in verghe transgenici, che indica che l'attivazione termica della S-pigmento non potrebbe contribuire a bassa sensibilità del mouse S-coni. Tramite asta arrestin animali knock-out (arr1-/-), abbiamo trovato che fisiologicamente attivi (meta II) stato di decadimenti di S-pigmento 40 volte più veloci rispetto a quella della rodopsina. Interessante, rod arrestin era efficiente nei disattivare S-pigmento in verghe, ma la cancellazione non ha avuto alcun effetto evidente sull'arresto di dim-flash risposta nei coni. Inoltre, non era in grado di salvare il lento spegnimento della risposta dim-flash S-pigmento in arr1/canne arrestin cono transgenico. Così, il collegamento tra asta/cono arrestins e spegnimento S-pigmento rimane poco chiaro.
Intra-retinal Ciclo Visivo Richiesto Per Adattamento Dark Cono Rapido E Completo
Visione diurna è mediata dai coni retinici, che, a differenza delle canne, rimangono funzionali anche in piena luce e dark-adapt rapidamente. Queste proprietà cono sono attivate dalla rapida rigenerazione della loro pigmento. Questo a sua volta richiede cromoforo rapido riciclaggio che non può essere raggiunto dal ciclo visual di epitelio pigmentato retinico canonica. Recenti studi di biochimica hanno suggerito la presenza di un cono-specifiche, secondo ciclo visivo, anche se la sua funzione fisiologica rimane essere stabilito. Abbiamo trovato che le cellule di Müller nella retina neurale Salamandra promuovono la rigenerazione del pigmento specifico del cono e adattamento dark che sono indipendenti l'epitelio pigmentato. Senza questo percorso, dark adattamento del coni è stato lento e incompleto. In particolare, le tariffe del cono del pigmento rigenerazione dalla retina e pigmento epitelio visual cicli erano essenzialmente identici, suggerendo un possibile passaggio di limitazione della velocità comune. Infine, abbiamo anche osservato adattamento dark cono nella retina del mouse isolato.
Ruoli Essenziali E Sinergici Di RP1 E RP1L1 Nell'assonema Fotorecettore Rod E Retinite Pigmentosa
Retinite pigmentosa 1 (RP1) è una comune retinopatia ereditaria con esordio variabile e la gravità. RP1 gene codifica per una proteina ciliare specifici del fotorecettore, microtubule-associated contenente il dominio doublecortin (DCX). Qui vi mostriamo che un altro specifico fotorecettore Rp1-come proteina (Rp1L1) nei topi è anche localizzata assonema dei segmenti esterni (OSs) e ciglia in fotorecettori asta di collegamento, sovrapposti con display sparsi OS disorganizzazione Rp1. Rp1L1-/-mice, ridotto l'elettroretinogramma ampiezze e degenerazione progressiva fotorecettore, meno grave e più lento nel Rp1/topi. Nelle singole barre di Rp1L1- /-, fotosensibilità è ridotto, simile a quello del Rp1-/-. Mentre gli eterozigoti individuali sono normali, doppi eterozigoti di Rp1 e Rp1L1 presentano morfologia anomala di OS e ridotta fotosensibilità asta singola e correnti scure. Le ampiezze l'elettroretinogramma degli eterozigoti doppie sono più ridotte rispetto a quelle degli eterozigoti individuali combinati. Nel supporto, Rp1L1 interagisce con Rp1 in celle transfected e negli esperimenti di pull-down di retina. È interessante notare che, phototransduction cinetica sono normali nel singoli canne ed intera retina di singoli o doppi Rp1 e Rp1L1 topi mutanti. Insieme, Rp1 e Rp1L1 svolgono ruoli essenziali e sinergici che interessano fotosensibilità e morfogenesi OS dei fotorecettori rod. I nostri risultati suggeriscono che le mutazioni RP1L1 potrebbero sottendono alla retinopatia o modificare RP1 espressione di malattia negli esseri umani.
Un Percorso Alternativo Da Intermediario Il Mouse E Il Ciclo Visivo Umano Cono
Uno dei misteri fondamentali del sistema visivo umano è la funzione dei fotorecettori cono continua nella luce del giorno luminoso. Come pigmento visivo è distrutto, o sbiancato, dalla luce, coni richiedono la rapida rigenerazione, che a sua volta comporta rapido riciclaggio del cromoforo del pigmento. Il canonico ciclo visual per asta e cono pigmenti coinvolge riciclaggio dei loro cromoforo da tutto-trans retinolo per 11-cis retinale nell'epitelio pigmentato, adiacente ai fotorecettori. Tuttavia, carenze di questo pathway indicano la funzione di un secondo, cono-specifici, meccanismo per cromoforo riciclaggio. Infatti, studi biochimici e fisiologici sulla specie inferiori hanno descritto un ciclo visual cono specifico oltre il pathway dell'epitelio lungo-saputo pigmento. Rimangono due domande importanti, però: Qual è il ruolo di questo percorso nella funzione dei coni dei mammiferi, ed è presente nei mammiferi superiori, inclusi gli esseri umani? Qui, ci mostra che mouse, primate e retina neurale umana promozione la rigenerazione del pigmento e adattamento dark selettivamente in coni, ma non in canne. Questo percorso supporta rapido adattamento dark dei coni dei mammiferi e si estende la gamma dinamica in sfondo luce indipendentemente l'epitelio pigmentato. Questo meccanismo di rigenerazione di pigmento è essenziale per la nostra visione diurna e sembra essere evolutivamente conservato.
Intercambiabilità Funzionale Dell'asta E Cono Transducina Subunità Alfa
Asta e cono fotorecettori utilizzano simili ma distinti gruppi di proteine phototransduction per ottenere diverse proprietà funzionali, adatti per il loro ruolo di recettori luce fioca e brillanti, rispettivamente. Per esempio, asta e cono visivo pigmenti due distinte varianti della proteina eterotrimerica G transducina. Tuttavia, il ruolo delle differenze strutturali tra asta e cono transducina subunità alfa (Talpha) nel determinare le differenze funzionali tra coni e bastoncelli è sconosciuto. Per rispondere a questa domanda, abbiamo studiato la traslocazione e proprietà di rod Talpha espressa in coni e cono di segnalazione Talpha espresso in verghe in ceppi tre mouse: rod Talpha knockout, mutante Talpha GNAT2(cpfl3) cono e rod e cono Talpha doppio rd17 mutante del mouse. Sorprendentemente, anche se l'asta/cono Talpha sono solo 79% identici, espresse in maniera esogena asta o cono Talpha localizzata e traslocata in modo identico a Talpha endogeno in ogni tipo di fotorecettore. Inoltre, esogenicamente espresso asta o cono Talpha salvato l'elettroretinogramma responses (ERG) in topi privi di cono funzionale o rod Talpha, rispettivamente. Ex vivo transretinal ERG e a cella singola registrazioni da retine rd17 trattate con asta o cono Talpha ha mostrato sensibilità paragonabile rod e cinetica di risposta. Questi risultati dimostrano che cono Talpha forma un complesso in canne e quel paio di Talpha rod e cono di proteine funzionali eterotrimerica G ugualmente bene alla cascata phototransduction rod. Così, asta e cono transducina subunità alfa sono funzionalmente intercambiabili e loro proprietà segnalazione non contribuiscono alle differenze tra coni e bastoncelli intrinseca sensibilità alla luce. Inoltre, la tecnologia utilizzata qui potrebbe essere adattata per qualsiasi tale swap omologo desiderato.
Effetto Della Chinasi 1 (Grk1) Di Recettori Accoppiati a Proteine G Sovraespressione Sull'attuabilità Delle Cellule Di Rod Fotorecettore
Fotorecettore rodopsina chinasi (Rk, chinasi di proteina-dipendente dal recettore G 1 [Grk1]) fosforila opsins-attivati e loro canali in un complesso inattivo con visual arrestins. Deficit di Grk1 conduce alla retinopatia umana e accresciuta suscettibilità alla morte delle cellule fotorecettrici luce-indotta in mouse. L'obiettivo di questo studio era di determinare se in eccesso Grk1 attività protettiva contro la morte delle cellule fotorecettrici.
Studi Fisiologici Dell'interazione Tra Opsin E Cromoforo in Asta E Cono Pigmenti Visivi
Il pigmento visivo in fotorecettori vertebrati è un recettori accoppiati a proteine G che è costituito da una proteina, opsin, covalentemente associata a un cromoforo, 11-cis-retinale. Attivazione del pigmento visivo di luce innesca una cascata di trasduzione che produce risposte elettriche sperimentalmente misurabili in fotorecettori. Le interazioni tra opsin e cromoforo possono essere studiate con electrophysiologial registrazioni in intatte anfibio e topo rod e cono cellule fotorecettrici. Qui descriviamo metodi per sostituire il cromoforo nativo con vari cromoforo analoghi per indagare come specifiche parti del cromoforo influenzano le proprietà di segnalazione del pigmento visivo e la funzione dei fotorecettori. Descriviamo anche metodi per geneticamente sostituendo il gene opsin nativo rod opsins cono o con opsins asta mutante per analizzare e confrontare le loro proprietà di segnalazione. Questi metodi sono utili non solo per la comprensione della relazione tra le proprietà dei pigmenti visivi e la funzione dei fotorecettori, ma anche per comprendere i meccanismi con cui mutazioni in opsin asta producono cecità notturna e altri disturbi visivi.
Età-correlate Deterioramento Della Visione Di Verga Nei Topi
Anche in individui sani, invecchiamento porta al deterioramento dell'acuità visiva, sensibilità al contrasto, campo visivo e l'adattamento di buio. Poco è conosciuto circa i meccanismi neurali che guidano i cambiamenti legati all'età della retina e, più specificamente, fotorecettori. Secondo un'ipotesi, il deterioramento relativo all'età in funzione di rod è a causa della disponibilità limitata di 11-cis-retinale per formazione di pigmento rod. Per determinare come invecchiamento colpisce fotorecettori rod e per testare l'ipotesi di deficit di retinoidi, abbiamo confrontato le proprietà morfologiche e funzionali delle canne di adulto e invecchiato topi B6D2F1/J. Abbiamo trovato che il numero di canne e la lunghezza dei loro segmenti esterni sono sensibilmente ridotti nei topi 2.5-anno-vecchio rispetto ad animali di 4 mesi. Invecchiamento provocato anche una duplice riduzione del livello complessivo di opsin nella retina. Test comportamentali ha rivelato che scotopica acuità visiva e la sensibilità al contrasto sono diminuiti da duplice nei topi anziani, e registrazioni di ERG rod dimostrato ridotta ampiezza di entrambi a - e b-onde. Sensibilità di canne all'età determinata dalla cella singola registrazioni era anche diminuito di 1.5-fold, corrispondente a non più di 1% gratis opsin in questi fotorecettori, e non sono stati modificati parametri cinetici della risposta flash dim. In particolare, il tasso di adattamento dark rod era influenzato dall'età. Così, i nostri risultati sostengono contro deficit legati all'età di 11-cis-retinale nel ciclo visivo rod di mouse B6D2F1/J. Sorprendentemente, il livello di rumore scuro cellulare è stato aumentato in verghe invecchiati, fornendo un meccanismo alternativo per loro desensibilizzazione.
Ancoraggio Subunità Membrana Specifica Regolazione Selettiva Della RGS9·Gbeta5 GAP Complessi Nei Neuroni Del Fotorecettore
Il RGS9·Complesso Gβ5 è il regolatore chiave della G-proteina di segnalazione neuronale e dimostra notevole selettività della composizione di subunità. In fotorecettori retinici, RGS9·Gβ5 è associato per l'ancoraggio della membrana R9AP e il complesso regola la segnalazione visiva. Nei neuroni dei gangli basali, RGS9·Gβ5 invece è associato a una proteina omologa, R7BP e regola il circuito della ricompensa. Questa composizione selettiva subunità del complesso di commutazione in fotorecettori rod ci ha permesso di studiare la base molecolare della segnalazione specificità in diversi percorsi di G-proteina. Abbiamo trovato che entrambe le subunità ancoraggio membrana svolgono un ruolo conservato nel regolare i livelli della proteina di RGS9·Gβ5 e rafforzare la capacità di RGS·Gβ5 complessi per stimolare attività GTPasi proteine G. Tuttavia, notevoli differenze esistono nel targeting sottocellulare di complessi in alternativa configurati. A differenza di R9AP, che si basa su meccanismi passivi targeting per la consegna ai segmenti esterni dei fotorecettori, R7BP è escluso da questa posizione e invece è specificamente mirate alla membrana del plasma. R7BP contenenti complessi potrebbero essere ridiretto ai segmenti esterni, dove sono in grado di regolare la cascata phototransduction dai segnali targeting attivi derivati dalla rodopsina. Questi risultati illustrano la diversità del regolamento G-proteina di segnalazione di RGS·Gβ5 complessi raggiunti dal reclutamento differenziale della membrana ancore.
Il Ciclo Visivo Specifico Del Cono
Fotorecettori cono mediano la nostra visione diurna e la funzione in condizioni di luce brillante e rapida evoluzione. Come loro pigmento visivo viene distrutto nel processo photoactivation, la funzione continua di coni impone la necessità di un rapido riciclaggio del loro cromoforo e rigenerazione di loro pigmento. Il ciclo visivo canonica retinoide attraverso le cellule dell'epitelio pigmentato retinico ricicla cromoforo e rifornisce sia bastoncelli e coni. Tuttavia, carenze di questo percorso, tra cui sua lentezza e la concorrenza con canne per cromoforo, hanno portato alla suggestione che coni potrebbero utilizzare un meccanismo separato per il riciclaggio del cromoforo. Negli ultimi quattro decenni gli studi biochimici hanno identificato attività enzimatiche coerente con riciclo cromoforo nella retina degli animali cono-dominante, come il pollo e lo scoiattolo di terra. Questi studi hanno portato all'ipotesi di un ciclo di visual retina cono-specifiche. La rilevanza fisiologica di questi studi è stato controversa per lungo tempo e prove per la funzione di questo ciclo visivo è emerso solo negli studi molto recenti e saranno il focus di questa recensione. Il ciclo visivo retina fornisce cromoforo e favorisce la rigenerazione del pigmento solo nei coni ma non in canne. Questo percorso è indipendente l'epitelio pigmentato e coinvolge invece le cellule di Müller nella retina, dove cromoforo è riciclata e fornito in modo selettivo a coni. La fornitura rapida di cromoforo attraverso il ciclo di retina visiva è fondamentale per estendere la gamma dinamica di coni di luce brillante e per il loro rapido adattamento buio dopo l'esposizione alla luce. L'importanza del ciclo visivo retina è sottolineato anche dalla sua conservazione attraverso l'evoluzione come sua funzione ora è stata dimostrata in specie che vanno da Salamandra di zebrafish, topo, primate e umana.
Interphotoreceptor Retinoid-proteina Come Vettore Fisiologicamente Rilevante Di 11-cis-retinolo Nel Ciclo Cono Visivo
Coni funzionano in luce costante e sono responsabili della mediazione della visione umana durante il giorno. Come canne, coni utilizzano la molecola fotosensibile 11-cis-retinale per rilevare la luce, e nel campo dell'illuminazione costante, è necessario un continuo rifornimento di 11-cis-retinale. Un ciclo di retina visiva è pensato per fornire un rifornimento privilegiato di 11-cis-retinale a coni utilizzando 11-cis-retinolo generato nelle cellule di Müller. Nel ciclo, 11-cis-retinolo viene trasportato dalle cellule di Müller a cono interni segmenti, dove si è ossidato a 11-cis-retinale. Questo passaggio di ossidazione viene eseguito solo nei coni, rendendo in tal modo il ciclo specifico del cono. Interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) è un retinoide-binding protein nello spazio al che lega 11-cis-retinolo endogena. Coni Irbp(-/-) topi sono retinoid-carenti condizioni di visione fotopica, ed è possibile che 11-cis-retinolo forniture sono interrotti in assenza di IRBP. Abbiamo testato l'ipotesi che IRBP facilita la fornitura di 11-cis-retinolo al coni da preservare lo stato isomerica di 11-cis-retinolo in luce. Con elettrofisiologia, mostriamo che i fotorecettori cono-come dei topi Nrl(-/-) utilizzano il ciclo visivo cono similmente al selvaggio-tipo coni. Quindi, utilizzando dosaggi di ossidazione in retine Nrl(-/-)Rpe65(-/-) isolate, mostriamo che IRBP offre 11-cis-retinolo per ossidazione in coni e migliora l'efficienza della reazione di ossidazione. Infine, ci mostra che la IRBP protegge lo stato isomerica di 11-cis-retinolo in presenza di luce. Insieme, questi risultati suggeriscono che la IRBP svolge un ruolo importante nella fornitura di 11-cis-retinolo per coni e può facilitare la funzione di cono in presenza di luce.
Variazione Nell'espressione Di Rodopsina Chinasi Altera La Risposta Dim Flash Spento E L'adattamento Di Luce Nei Fotorecettori Rod
Fotorecettori Rod sono squisitamente sensibili rilevatori di luce che funzionano in penombra. L'inattivazione tempestiva delle loro risposte luce è fondamentale per la capacità di canne attendibilmente rilevare e contare i fotoni. Un passaggio chiave nella inattivazione di trasduzione dell'asta è la fosforilazione del rod visual pigmento, rodopsina, catalizzata dalla chinasi del recettore G-proteina-dipendente 1 (GRK1). Assenza di GRK1 notevolmente prolunga luce risposta dei fotorecettori e migliora la loro suscettibilità alla degenerazione. Questo studio ha esaminato le risposte luce dai coni retinici del mouse che esprimono livelli diversi di GRK1 a valutare quanto la loro funzione è modulata dalla inattivazione di rodopsina.
Il Ciclo Visivo Dei Mammiferi Cono Promuove La Rapida Rigenerazione Del Pigmento M/L-cono Indipendentemente Il Retinoide-binding Protein Interphotoreceptor
Rapida rigenerazione del pigmento visivo seguendo il photoactivation è critico per la funzione dei fotorecettori cono tutto il giorno. Anche se le reazioni del ciclo visivo nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) che riciclano cromoforo per la rigenerazione del pigmento rod sono ben caratterizzate, i corrispondenti meccanismi che consentono la rapida rigenerazione del pigmento cono sono mal capiti. Una domanda chiave rimanente è il contributo relativo della retina recentemente scoperto cono specifico ciclo visivo e il classico RPE-dipendente visual ciclo di rigenerazione del pigmento mammifero cono. Inoltre, non è chiaro quale ruolo, se del caso, l'abbondante interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) si presume per facilitare il traffico del cromoforo, gioca nell'accelerare la rigenerazione del pigmento cono dei mammiferi. Per risolvere questi problemi, abbiamo usato transretinal registrazioni per valutare la rigenerazione pigmento M/L-cono in retine isolate e paraocchi da controllo e mouse IRBP-carenti. Notevolmente, la retina di topo promosso M/L-cono oscuro adattamento otto volte più velocemente che l'EPR. Tuttavia, cono completo recupero necessari entrambi i cicli di visual. Possiamo concludere che il ciclo visivo retina è critico per la rapida rigenerazione iniziale del mouse pigmento M/L-cono durante l'adattamento dark, considerando che il ciclo più lento di visual RPE è necessario per completare il processo. Mentre l'eliminazione dei IRBP ridotta ampiezza e rallentato la cinetica del mouse M/L-cono photoresponses, adattamento del cono di luce costante e la cinetica del cono oscuro adattamento non sono stati influenzati nella retina isolato o nell'oculare intatto. Così, IRBP non accelerare la rigenerazione del pigmento cono e non è critico per la funzione del mouse M/L-coni in piena luce.
Ruolo Di Modulazione Di Guanil Ciclasi in Mouse Cono Phototransduction
Un feedback negativo phototransduction in coni e bastoncelli è fondamentale per la risoluzione tempestiva delle loro risposte luce e per estendere la loro funzione per una vasta gamma di intensità luminose. I meccanismi di feedback calcio che modulano phototransduction in coni retinici sono stati studiati estesamente. Tuttavia, i meccanismi di modulazione corrispondente che consentono coni di terminare rapidamente le loro risposte di luce e di adattarsi in piena luce, proprietà fondamentale per la nostra visione diurna, ancora non sono chiari. Nei coni, calcio feedback a guanil ciclasi è potenzialmente un passaggio chiave nella modulazione phototransduction. L'attività di guanil ciclasi è modulata dalla ciclasi guanil associazione calcio attivando proteine (GCAP1 e GCAP2). Qui, abbiamo utilizzato la cella singola e transretinal le registrazioni da mouse per determinare come GCAPs modulare dark-adapted risposte, come pure la luce adattamento nei coni dei mammiferi. Eliminazione di GCAPs triplice l'ampiezza è aumentato e prolungato drammaticamente le risposte luce nei coni dark-adapted del mouse. Esso ha inoltre ridotto il campo di funzionamento dei coni del mouse nell'illuminazione di sfondo e gravemente compromessa loro adattamento di luce. Così, GCAPs esercitare una potente modulazione sulla cascata phototransduction cono dei mammiferi e gioca un ruolo importante nell'impostazione delle proprietà funzionali di coni nell'oscurità e durante l'adattamento di luce. Sorprendentemente, nonostante la loro capacità di adattamento migliore e più ampia gamma dinamica di calcio, coni dei mammiferi sono stati modulati dal GCAPs in misura minore rispetto a canne dei mammiferi. Possiamo concludere che una disparità nella forza di modulazione GCAP non può spiegare le differenze nelle proprietà dark-adapted o nelle gamme di funzionamento dei mammiferi bastoncelli e coni.
G-proteina Betagamma-complesso è Cruciale Per L'amplificazione Del Segnale Efficiente in Visione
Una questione fondamentale della cellula biologia è come deboli segnali esterni di segnalazione produrre risposte fisiologiche robuste. Un meccanismo universale si basa sull'amplificazione del segnale via cascate intracellulari mediata da eterotrimerica G-proteine. Questo sistema di amplificazione ad alta permette di fotorecettori della retina asta rilevare i singoli fotoni di luce. Anche se ora molto è conosciuto circa il ruolo della α-subunità dell'asta specifica G-proteina transducina in phototransduction, la funzione fisiologica del βγ-complesso ausiliario in questo processo rimane un mistero. Qui, ci mostra che eliminare la subunità γ transducin riduce drasticamente l'amplificazione del segnale nelle barre del mouse intatto. La conseguenza è un calo impressionante sensibilità visiva rod e grave deterioramento della visione notturna. I nostri risultati dimostrano che transducina complesso βγ controlli di amplificazione del segnale della cascata phototransduction rod ed è fondamentale per la capacità dei fotorecettori asta di funzionare in condizioni di scarsa illuminazione.
Asta E Cono Di Pigmenti Visivi E Phototransduction Attraverso Approcci Farmacologici, Genetici E Fisiologici
Attivazione del pigmento visivo di luce nei fotorecettori rod e cono avvia la nostra percezione visiva. Di conseguenza, le proprietà di segnalazione dei pigmenti visivi, costituito da una proteina, opsin e un cromoforo, 11-cis-retinale, giocano un ruolo fondamentale nel plasmare la luce risposte dei fotorecettori. La combinazione di strumenti farmacologici, fisiologici e genetici è stato un approccio potente avanzare la nostra comprensione delle interazioni tra opsin e cromoforo e come influenzano la funzione dei pigmenti visivi. Le proprietà di segnalazione dei pigmenti visivi modulano molti aspetti della funzione di coni e bastoncelli, producendo la loro unica proprietà fisiologiche.
Segnalazione Degli Stati Di Rodopsina in Asta Disco Membrane Manca Transducin Complesso βγ
Scopo. A caratterizzare il possibile ruolo della transducina Gtβγ-complesso nel modulare le proprietà di segnalazione della rodopsina photoactivated e la sua durata in asta disco membrane e canne intatti. Metodi. Fotolisi di rodopsina è stata studiata tramite spettroscopia UV-visibile e spettroscopia scansione rapida in presenza di idrossilammina in membrane di disco asta altamente purificati del mouse wild-type e Gtγ-carenti. Formazione di complessi tra photoactivated rodopsina e transducina è stata misurata mediante saggio II extra-semplice (meta). Recupero della sensibilità attuale e flash scura in canne singole intatto wild-type e Gtγ-carenti del mouse è stata misurata dalla cella singola aspirazione recordings. Risultati. Photoconversion della rodopsina a meta mi / equilibrio II meta procede normalmente dopo l'eliminazione del Gtβγ-complesso. La meta mi / meta II rapporto, il tasso di decadimento di meta II, la reattività del meta II verso idrossilammina e il tasso di formazione III meta nelle membrane di Gtγ-deficient asta disco erano identici a quelli osservati in campioni di wild-type. Sotto illuminazione di bassa intensità, la quantità di extra-meta II in dischi di Gtγ-deficient era significativamente ridotta. Il tasso iniziale di recupero corrente scura dopo candeggina 12% rodopsina era tre volte più veloce nelle barre di Gtγ-deficient, considerando che il tasso di recupero corrente tardo era in gran parte invariato. Mutante canne esposte anche più veloce postbleach recupero di sensibilità flash. Conclusioni. Photoactivation e decomposizione termica della rodopsina procedere analogamente nel wild-type e canne del mouse Gtγ-carenti, ma la formazione di complessa tra photoactivated rodopsina e transducina è gravemente compromessa in assenza di Gtβγ. L'attivazione di trasduzione risultante inferiore contribuisce a fotorisposta recupero più veloce dopo un moderato pigmento candeggina nelle barre di Gtγ-deficient.
