Summary
Микроконтактной печати широко используется для картины белков и других молекул на поверхности материалов. Мы продемонстрируем основные этапы этого процесса, штамповки модели фибронектина на стекло.
Abstract
Способность шаблон белков и других биомолекул на подложки важно для захвата пространственной сложности внеклеточной среде. Развитие микроконтактной печати группой Уайтсайдс (
Protocol
1. Подготовка решений и материалов
Эти меры должны осуществляться за несколько дней.
- Стекла покровные. Покровные стекла были очищены путем погружения в течение 10 минут в раствор моющего средства Linbro 7X: вода, смешанная в 1: 3 соотношение и нагревают при перемешивании до момента отрыва. Покровные стекла промывали широко деионизированной водой, а затем выпекают при температуре 450 ° С в течение 6 часов. Загрузка покровных в керамические стойки окрашивания (см. реагенты) упрощенные этого процесса.
- Белки решение для штамповки. Развести фибронектина следующих производителей инструкции исходного раствора 1 мг / мл.
2. В ролях марок из топологических мастера
Эти шаги могут быть проведены за несколько дней. Магазин марки шаблону в закрытые сосуды, например, блюдо культуры ткани.
- Не надевайте свободную пыль от мастера, используя поток сжатого, фильтруют воздухом или инертным газом.
- Место мастером, узорчатое стороной вверх, в нижней части пластиковой блюдо просто больше, чем хозяин. 60 - или 100-мм блюда культуре ткани хорошо подходят для этой цели.
- В полистирола 50 мл центрифужную пробирку, объединить Sylgard компонентов в пропорции отвердитель: эластомер базе 1: 10 по весу. Тщательно перемешать с помощью пластикового устройства, например, одноразовые пипетки. Подготовка не менее 0,2 мл из эластомера на квадратный сантиметр блюдо области.
- Центрифуга 50 мл трубку при 300 G в течение 5 мин для удаления пузырьков воздуха.
- Налейте эластомера над мастером, затем поместить в эксикаторе под вакуумом, в течение 30 минут.
- Cure эластомера в духовке при температуре 65 ° С в течение не менее 2 часов. Отверждение при более высокой температуре и более длительное время приводит к жесткой эластомера. Дайте остыть до комнатной температуры.
- Отдельный лист марок от хозяина.
3. Микроконтактной печати фибронектина на стекло
- Вырежьте одну марку. Марки размером 4 мм х 4 мм до 1 см х 1 см в области и 1 - 2 мм толщиной легче всего начать с. Место шаблон вверх на предметное стекло или блюдце пластика.
- Место штампа в чистой плазмы, и процесс, в вакууме, в течение 30 секунд. Harrick Научно плазмы чистых (см. оборудование), установлена на уровне самой высокой выходной параметр будет оказывать поверхности PDMS гидрофильными. Дольше раз привести к растрескиванию эластомера.
- Развести фибронектина решение с деионизированной водой штамповки концентрации 50 мкг / мл.
- Нанесите небольшое падение (10 - 50 мкл) штамповки решение на печать. Она будет распространяться через гидрофильные поверхности. Добавить хватает только решения, падение охватывает печать, но не работает по краям. Давайте белка адсорбироваться на печать на 5 минут.
- Использование ® Kimwipe или другой чистой бумагой, фитиль от большинства белков раствор из штамп, не прикасаясь к узорной регионе.
- Сухой оставшийся раствор из штамп под струей чистой, сухой, инертным газом, например азотом.
- С помощью пинцета удалите штамп стекло, инвертирование, и место в контакт с очищенное стекло покровное (поверхность, чтобы быть составлены по образцу). Место вес на вершине, чтобы способствовать хороший контакт. Удельный вес, который обеспечивает лучшее структурирование зависит от размера печати и рисунка; начать с 5 г веса, а также настроить между штамповок. Оставьте штамп в контакте с поверхностью в течение 1 минуты.
- Аккуратно разобрать стек, так и отдельные штамп покровное.
- Энергично промыть узорной покровное в ФСБ, а затем деионизированной водой, чтобы удалить белок, который не адсорбируются на поверхности. Сухой покровное под потоком азота.
Представитель Результаты
Микроконтактной печати мощный процесс структурирования молекул на поверхности. Этот процесс имеет возможность создавать функции с размерами от десятков микрон до сотен нанометров; на рис. 1А, логотипы на левом каждый 200 мкм в высоту, в то время как зеленые пятна на рис. 1В 1 мкм в диаметре и расположенные на 4 мкм промежутки времени, измеряется от центра до центра. Рис. 1В также иллюстрирует мощный собственности микроконтактных печати, а именно, что это такое и аддитивный процесс. Несколько раундов микроконтактной печати может быть применен к одной поверхности для создания многокомпонентных систем 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процесс микроконтакта печати концептуально простой и надежный в эксплуатации, будучи применены к структурирование широкого спектра молекул на различных подложках. Однако этот процесс остается чем-то вроде искусства. Конкретной геометрией картины должны быть созданы, белка, чтобы быть с рисунком, применяются веса, и покрытие / тиснения условиях все это влияет на качество тиснения. Например, слишком мало веса, нанесении на большие возможности, часто приводит к пробелы в схеме, что можно увидеть в правом верхнем углу логотип на рис. 1А. С другой стороны, слишком большой вес вызовет провисание и распада штампа, в результате непреднамеренных отложение белка в регионах в период с узорной features.As втором примере, специфические белки (например, антитела) картина с точностью лучше, если шаг плазменной обработки опущен, оставляя PDMS гидрофильными. Штамповки фибронектина на стекло представлена здесь в качестве отправной точки для таких модификаций и оптимизаций, демонстрируя основные приемы этого процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
