Summary
Этот протокол свидетельствует о том, как рассекают
Abstract
Protocol
Перед тем как начать
- Все культуры следует выращивать при температуре 25 ° C.
- HL3.1 рассечение буфер может быть подготовлен заранее. Возьмите 50 мл аликвоту HL3.1 и держать его на льду.
- Подготовка 15 мл свежего 3,5% формальдегида в HL3.1. Держите его на лед.
Личинки Dissection
- Поместите каплю холодной HL3.1 на вскрытии пластины. Это будет держать животных от высыхания и оглушить животное делает его легче работать.
- Использование длинный пинцет, выберите блуждающих третьей взрослой личинки и поместить его в каплю HL3.1.
- Во-первых, использовать короткие щипцы понять контактный minutien. Место контактный между задних дыхальца. Животных, как правило, пытается отползти от контактный растяжения себя, и делает его более легким для вас место контактный прямо в голову личинки в районе устья крючков. Стретч животное из продольно. Это поможет вам максимизировать количество выставленных стенки тела можно достичь в процессе резки. Примечание: Если вы решили контактный головой вперед, животное может обернуть его вокруг тела булавкой или кнут своего тела вперед и назад, что делает его трудно точно определить. Обычно вы можете противостоять этому, удалив HL3.1 и положить свежие холодная капля потрясающих животных снова. Симметричная ученый также можете просто схватить животное и удерживать его на месте.
- Использование ножниц весной сделать горизонтальный надрез только впереди задний штифт на спинной стороне личинки. Разместите один лезвие ножниц в разрез и сделать вертикальный разрез по средней линии спины к ростральной конце личинки. На трибуну животных делают горизонтальные разрезы, чтобы слева и справа от булавки. Примечание: конечный результат должен выглядеть так я на спинной стороне личинки вместе rostrocaudal оси.
- Удалить органов. Начните, положив несколько дополнительных капель HL3.1 на личинку. Это позволит органам всплывают из организма позволяет удалить их гораздо легче. Во-первых, удалите трахеи системы. Во-вторых, использование щипцов, чтобы захватить остальные органы и удалить их.
- В шаге 3 вы сделали левый и правый клапан клапан в стенке тела. Pin закрылки по часовой стрелке и обязательно растягивать стенки тела по горизонтали и по вертикали.
Фиксация
Fix каждого животного в 3,5% формальдегида в HL3.1 течение 25 минут. Мыть животное дважды в HL3.1 течение 5 минут.
Хранение
Удалите булавки и передачи личинок 1,5 мл пробирку 1X PBS. Если вы планируете изображение NMJ использовании плавленого флуоресцентные метки, Вы должны изображение животных в течение двух дней. Вы можете хранить расчлененный личинок на срок до одной недели при температуре 4 ° C.
Представитель результаты
Есть несколько ключевых компонентов правильно расчлененные личинки дрозофилы. Во-первых, нужно проявлять особую осторожность, чтобы не повредить мышцы, особенно мышцы 4, 6 и 7. Это самый популярный мышцы учиться и, если они повреждены отказаться филе приготовительные и анализировать другим животным. Во-вторых, надо убедиться, что животное максимально растягивается так, что каждая мышца и NMJ можно выделить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение технику продемонстрировал в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы личинок для различных экспериментальных методик. Если флуоресцентные метки белка присутствуют, личинки могут быть смонтированы и отображаемого сразу. В противном случае, иммунной могут быть выполнены для того, чтобы помечать определенные синаптические отсеков. Кроме того, электрофизиологии могут быть легко выполнены на расчлененный личинки оценить функционирование нервных импульсов.
NMJ дрозофилы приобрел большую популярность с начала исследования, освещенные его основные структуры и функции. 1-4 Многие из молекул, которые были выявлены при исследовании развития Drosophila NMJ сохраняются у позвоночных. 4 Таким образом, многие из идеи, извлеченные в ходе исследования дрозофилы NMJ применимы к синаптической биологии во всех живых существах. Некоторые возможные применения включают в себя изучение молекул, участвующих в руководстве аксона, заболевания двигательных нейронов, обучения и памяти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
