Summary
Detta protokoll visar hur man dissekera
Abstract
Den
Protocol
Innan du börjar
- Alla kulturer bör odlas vid 25 ° C.
- HL3.1 dissektion buffert kan beredas i förväg. Ta en 50 ml alikvot av HL3.1 och hålla den på is.
- Förbered 15 ml färsk 3,5% Formaldehyd i HL3.1. Håll det på is.
Larver Dissection
- Sätt en droppe kallt HL3.1 på dissekering plattan. Detta kommer att hålla djuret från att torka och bedöva djuret gör det lättare att arbeta med.
- Med hjälp av lång pincett, välj en vandrande third INSTAR larv och placera den i droppe HL3.1.
- Först använder korta pincett att greppa en minutien stift. Placera stiftet mellan den bakre spiracles. Djuret kommer vanligtvis att försöka krypa bort från stift sträcker sig ut och göra det lättare för dig att placera ett stift rakt i huvudet på larven nära munnen krokar. Sträck djuret ut på längden. Detta hjälper dig att maximera mängden exponerade kroppen vägg du kan uppnå under bearbetning. Anm: Om du väljer att fästa huvudet först, kan djuret linda sin kropp runt stiftet eller piska sin kropp fram och tillbaka gör det svårt att stift. Du kan oftast motverka detta genom att ta bort HL3.1 och sätta en ny kall droppe fantastiska djuret igen. Den ambidextrous vetenskapsman kan också bara ta tag i djuret och hålla den på plats.
- Använda våren sax göra ett horisontellt snitt bara främre till den bakre stiftet på ryggsidan av larven. Placera en bladet på saxen i snitt och göra ett vertikalt snitt längs ryggens mittlinje mot rostralt slutet av larven. På podiet av djuret göra horisontella snitt till vänster och höger om pin. Obs: det färdiga resultatet ska se ut ett jag på ryggsidan av larven längs rostrocaudal axeln.
- Ta bort organ. Börja med att sätta flera ytterligare droppar HL3.1 på larven. Detta gör det möjligt för organen att flyta upp ur kroppen så att du kan ta bort dem mycket lättare. Först bort luftrör systemet. För det andra använder pincett för att ta resten av organ och ta bort dem.
- Under steg 3 som du har gjort en vänster lucka och höger klaff i kroppen väggen. Nåla fast lappar i en medsols för att se till att stretcha kroppen väggen både horisontellt och vertikalt.
Fixering
Fix varje djur hos 3,5% formaldehyd i HL3.1 i 25 minuter. Tvätta djuret två gånger i HL3.1 i 5 minuter.
Förvaring
Ta bort stiften och överföra larver till ett 1,5 ml rör som innehåller 1X PBS. Om du planerar att bilden NMJ med smält fluorescerande taggar bör du bilden djuren inom två dagar. Du kan lagra dissekerade larver i upp till en vecka vid 4 ° C.
Representativa resultat
Det finns flera viktiga komponenter till ett korrekt dissekeras Drosophila larv. Först måste man vara extra noga med att inte skada musklerna, särskilt muskler 4, 6 och 7. Dessa är de mest populära muskler för att studera och om de är skadade kasta filén prep och dissekera annat djur. För det andra måste man se till att djuret maximalt sträcks så att varje muskel och NMJ kan urskiljas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dissekering tekniken demonstreras i denna video kan användas för att förbereda Drosophila larver för en mängd olika experimentella tekniker. Om fluorescerande proteinet taggar är närvarande, kan larverna monteras och avbildas direkt. Annars kan immunfärgning göras för att markera specifika synaptisk fack. Dessutom kan elektrofysiologi enkelt utföras på dissekerade larver för att utvärdera hur neurotransmission.
Den NMJ i Drosophila har vunnit stor popularitet sedan början av studier som belyst dess grundläggande struktur och funktion. 1-4 Många av de molekyler som har identifierats i studier av utvecklingen av Drosophila NMJ bevaras hos ryggradsdjur. 4 Därför är många av de insikter lärt sig genom studier av Drosophila NMJ är tillämpliga på synaptiska biologi i alla levande varelser. Några möjliga tillämpningar är studier av molekyler som är inblandade i axonet vägledning, motor neuron sjukdom, inlärning och minne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
