Summary
Ce protocole démontre comment disséquer
Abstract
L'
Protocol
Avant de commencer
- Toutes les cultures doivent être cultivées à 25 ° C.
- HL3.1 tampon dissection peut être préparé à l'avance. Prenez une aliquote de 50 ml de HL3.1 et le garder sur la glace.
- Préparer 15 ml de formaldéhyde 3,5% frais dans HL3.1. Gardez-le sur la glace.
Dissection des larves
- Mettre une goutte de HL3.1 froid sur le plateau de dissection. Cela permet de garder l'animal de se dessécher et de l'étourdissement rend plus facile à travailler.
- Utilisation de la pince à long, sélectionnez une errance troisième stade larvaire et le placer dans la goutte de HL3.1.
- Tout d'abord, l'utilisation de pinces pour saisir courte une épingle minutien. Placez la broche entre les stigmates postérieurs. L'animal sera généralement tenter de s'éloigner en rampant de la broche qui s'allongea et de le rendre plus facile pour vous de placer une épingle carrément dans la tête de la larve à proximité de la crochets bouche. Étirez l'animal hors de la longueur. Cela vous aidera à maximiser la quantité de paroi du corps exposées que vous pouvez réaliser pendant la coupe. Remarque: Si vous choisissez à la broche de la tête la première, l'animal peut envelopper son corps autour de l'axe ou le fouet de son corps d'avant en arrière ce qui rend difficile à cerner. Vous pouvez habituellement contrer cela en supprimant le HL3.1 et mettre une goutte douce froide étonnante de l'animal à nouveau. Le scientifique ambidextres pouvez aussi attraper l'animal et le maintenir en place.
- Des ciseaux à ressort aide faire une incision horizontale juste en avant à la broche postérieure sur la face dorsale de la larve. Placer une lame des ciseaux dans l'incision et faire une coupe verticale le long de la ligne médiane dorsale vers la fin rostrale de la larve. A la tribune de l'animal faire des incisions horizontales à gauche et à droite de l'épingle. Remarque: le résultat final devrait ressembler à un I sur la face dorsale de la larve dans l'axe rostrocaudal.
- Enlever les organes. Commencez par mettre quelques gouttes supplémentaires de HL3.1 sur la larve. Cela permettra aux organes de flotter jusqu'à l'extérieur du corps vous permettant de les retirer plus facilement. D'abord, enlever le système trachéal. Deuxièmement, l'utilisation de la pince pour saisir le reste des organes et de les supprimer.
- Lors de l'étape 3, vous faites un rabat à gauche et volet droit de la paroi du corps. Epingler les rabats dans un sens horaire en veillant à étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement.
Fixation
Fixer chaque animal dans du formol 3,5% en HL3.1 pendant 25 minutes. Laver l'animal à deux reprises en HL3.1 pendant 5 minutes.
Stockage
Retirez les broches et le transfert des larves dans un tube de 1,5 ml contenant du PBS 1X. Si vous prévoyez d'utiliser l'image de la JNM fusionné étiquettes fluorescentes, vous devriez l'image des animaux dans les deux jours. Vous pouvez stocker les larves disséquées pour une semaine au maximum à 4 ° C.
Les résultats représentatifs
Il ya plusieurs éléments clés pour une larve de drosophile bien disséqué. D'abord, il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne pas endommager les muscles, surtout les muscles 4, 6 et 7. Ce sont les muscles les plus populaires pour étudier et, si elles sont endommagées jeter le filet de préparation et de disséquer un autre animal. Deuxièmement, on doit s'assurer que l'animal est au maximum étirée de sorte que chaque muscle et JNM peuvent être distinguées.
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Discussion
La technique de dissection démontré dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des larves de drosophile pour une variété de techniques expérimentales. Si les balises protéine fluorescente sont présents, les larves peuvent être montés et imagé immédiatement. Sinon, immunomarquage peuvent être effectuées afin de marquer spécifiques compartiments synaptiques. En outre, l'électrophysiologie peut facilement être effectuée sur des larves disséquées afin d'évaluer le fonctionnement de la neurotransmission.
Le MNJ de la drosophile a gagné une grande popularité depuis les premières études qui a illuminé de sa structure de base et la fonction. 1-4 Beaucoup de molécules qui ont été identifiés dans les études sur le développement de la drosophile JNM sont conservées chez les vertébrés. 4 Par conséquent, beaucoup de les idées apprises à travers des études de l'JNM drosophile sont applicables à la biologie synaptiques dans tous les êtres vivants. Certaines applications possibles incluent l'étude des molécules impliquées dans le guidage axonal, maladie du motoneurone, l'apprentissage et la mémoire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
