Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח
Abstract
Protocol
לפני שתתחיל
- תרבויות כל צריך להיות גדל ב 25 ° C.
- HL3.1 חיץ לנתיחה עשוי להיות מוכן מראש. קחו aliquot 50 מ"ל של HL3.1 ולשמור על הקרח.
- הכן 15 מ"ל של 3.5% פורמלדהיד טרי HL3.1. שמור את זה על הקרח.
הזחל Dissection
- שים טיפת HL3.1 קר בצלחת לנתיחה. זה ימשיך את החיה מן ייבוש להמם את החיה מה שמקל לעבוד איתו.
- בעזרת מלקחיים ארוכים, בחר נדודים third הזחל instar ולמקם אותו טיפה של HL3.1.
- ראשית, להשתמש במלקחיים קצר לתפוס סיכה minutien. מניחים את הסיכה בין spiracles האחורי. בעלי חיים בדרך כלל מנסים לזחול ולהתרחק הסיכה מתיחה עצמו ואת מה שמקל לך מקום סיכה ישר לראשו של זחל ליד ווים הפה. למתוח את החיה החוצה לאורכו. זה יעזור לכם למקסם את כמות קיר הגוף חשוף אתה יכול להשיג במהלך החיתוך. הערה: אם תבחר להצמיד את הראש ראשונה, החיה יכולה לעטוף את גופו סביב הפין או שוט גופו קדימה ואחורה ולכן קשה סיכה. בדרך כלל אפשר נגד זה על ידי הסרת HL3.1 ולשים טיפה קר טרי מהמם החי שוב. המדען המותאם לשתי יכול גם פשוט לתפוס את החיה להחזיקו במקום.
- מספריים באביב שימוש לעשות חתך אופקי קדמית פשוט להצמיד האחורי בצד הגב של הזחל. מקום אחד להב המספריים לתוך החתך ולעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע הגב לקראת סוף מקורי של הזחל. באותו דוכן של החיה לעשות חתכים אופקיים על ימין ועל שמאל של הסיכה. הערה: את התוצאה סיים צריך להיראות אני בצד הגב של הזחל לאורך ציר rostrocaudal.
- הסר את האיברים. בגין על ידי הצבת כמה טיפות נוספות של HL3.1 על הזחל. זה יאפשר האיברים לצוף אל מחוץ לגוף ומאפשר לך להסיר אותם בקלות רבה יותר. ראשית, להסיר את מערכת קנה הנשימה. שנית, יש להשתמש במלקחיים כדי לתפוס את שאר האיברים ולהסיר אותם.
- במהלך שלב 3 שביצעת כנף שמאל כנף ימין בקיר הגוף. הצמד את שולי כדי השעון לוודא למתוח את קיר הגוף אופקית ואנכית.
קיבוע
תקן כל חיה בפורמלין 3.5% HL3.1 במשך 25 דקות. לשטוף את החיה פעמיים HL3.1 במשך 5 דקות.
אחסון
הסר את הסיכות ולהעביר את הזחלים כדי צינור 1.5 מ"ל המכיל 1X PBS. אם אתם מתכננים התמונה NMJ באמצעות תגי פלורסנט התמזגו, אתה צריך תמונה החיות בתוך יומיים. אתה יכול לאחסן את הזחלים גזור עד שבוע אחד 4 ° C.
נציג תוצאות
ישנם מספר מרכיבים מרכזיים הזחל תסיסנית גזור כראוי. ראשית, יש לטפל נוספת לא לפגוע השרירים, במיוחד שרירי 4, 6 ו 7. אלו הם השרירים הכי פופולרי ללמוד אם הם פגומים להתעלמות מכין פילה ו לנתח חיה אחרת. שנית, יש לוודא כי בעל החיים הוא נמתח מקסימאלי, כך שכל השרירים NMJ ניתן להבחין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה לנתיחה הפגינו וידאו זה יכול לשמש כדי להכין את הזחלים תסיסנית עבור מגוון רחב של טכניקות ניסוי. אם תגי חלבון פלואורסצנטי נוכחים, הזחלים יכול להיות מותקן הדמיה מיד. אחרת, immunostaining יכול להתבצע על מנת לסמן תאים סינפטי ספציפי. בנוסף, electrophysiology יכול בקלות להתבצע על הזחלים גזור כדי להעריך את התפקוד של עצבית.
NMJ של תסיסנית צברה פופולריות רבה מאז מחקרים מוקדמים שהאיר המבנה הבסיסי שלה לתפקד. 1-4 רבות של מולקולות אשר זוהו במחקרים של התפתחות NMJ תסיסנית שמורים בתוך החוליות. 4 לכן, רבים התובנות למדו באמצעות מחקרים של NMJ תסיסנית החלות על הביולוגיה הסינפטי בכל היצורים החיים. כמה יישומים אפשריים כוללים את המחקר של מולקולות מעורבים הדרכה האקסון, מחלת הנוירון המוטורי, למידה וזיכרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
