Summary
Este protocolo demonstra como dissecar
Abstract
O
Protocol
Antes de começar a
- Todas as culturas devem ser cultivadas a 25 ° C.
- HL3.1 tampão dissecção pode ser preparado com antecedência. Dê uma alíquota de 50 ml de HL3.1 e mantê-lo no gelo.
- Prepare 15 ml de formaldeído 3,5% fresco em HL3.1. Mantê-lo no gelo.
Dissecação das larvas
- Coloque uma gota de HL3.1 fria na placa de dissecção. Isto irá manter o animal de secagem e atordoar o animal tornando-o mais fácil de trabalhar.
- Usando a pinça longa, selecione um errante larva de terceiro instar e coloque-o na queda de HL3.1.
- Primeiro, utilize uma pinça curta para agarrar um alfinete minutien. Coloque o pino entre os espiráculos posteriores. O animal normalmente irá tentar arrastar para longe o pino estendendo-se para fora e tornando mais fácil para você colocar um pino diretamente na cabeça da larva perto os ganchos na boca. Estique o animal no sentido longitudinal. Isso irá ajudá-lo a maximizar a quantidade de parede do corpo exposto você pode conseguir durante o corte. Nota: Se você optar por fixar a cabeça primeiro, o animal pode envolver seu corpo em torno do pino ou chicote o seu corpo para trás e para frente o que dificulta a pino. Geralmente você pode contrariar esta removendo o HL3.1 e colocando uma gota limpa e fria impressionante o animal novamente. O cientista ambidestro também pode simplesmente pegar o animal e mantê-lo no lugar.
- Tesoura primavera, utilizando fazer uma incisão horizontal logo anterior ao pino posterior no lado dorsal da larva. Coloque uma lâmina da tesoura na incisão e fazer um corte vertical ao longo da linha média dorsal até o final rostral da larva. Na tribuna do animal fazer incisões horizontal para a esquerda e direita do pino. Nota: o resultado final deverá ser parecido com um I do lado dorsal da larva ao longo do eixo rostro-caudal.
- Remover os órgãos. Comece por colocar várias quedas adicionais da HL3.1 na larva. Isso permitirá que os órgãos de flutuar para fora do corpo que lhe permite removê-los muito mais facilmente. Primeiro, remova o sistema traqueal. Em segundo lugar, use a pinça para pegar o resto dos órgãos e removê-los.
- Durante a etapa 3, você fez um flap flap esquerdo e direito na parede do corpo. Pin as abas em uma ordem no sentido horário certificando-se de esticar a parede do corpo tanto horizontalmente quanto verticalmente.
Fixação
Fix cada animal em formol 3,5% em HL3.1 por 25 minutos. Lavar o animal duas vezes na HL3.1 por 5 minutos.
Armazenamento
Remova os pinos e transferir as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo 1X PBS. Se você pretende usar a imagem do MNJ fundido etiquetas fluorescentes, você deve imagem dos animais dentro de dois dias. Você pode armazenar as larvas dissecadas por até uma semana a 4 ° C.
Resultados representativos
Existem vários componentes chave de uma larva Drosophila devidamente dissecado. Primeiro, é preciso tomar cuidado extra para não danificar os músculos, principalmente os músculos 4, 6 e 7. Estes são os músculos mais populares de estudar e se eles forem danificados descartar a prep filé e dissecar um outro animal. Em segundo lugar, é preciso se certificar de que o animal é esticado ao máximo para que cada músculo e MNJ podem ser distinguidos.
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Discussion
A técnica de dissecação demonstrou neste vídeo pode ser usado para preparar larvas Drosophila para uma variedade de técnicas experimentais. Se as tags proteína fluorescente estão presentes, as larvas podem ser montados e representado imediatamente. Caso contrário, imunocoloração podem ser realizadas a fim de marca específica compartimentos sináptica. Além disso, eletrofisiologia pode facilmente ser executada no larvas dissecadas para avaliar o funcionamento da neurotransmissão.
O MNJ de Drosophila ganhou grande popularidade desde os estudos iniciais que iluminou a sua estrutura básica ea função. 1-4 Muitas das moléculas que têm sido identificados em estudos de desenvolvimento do MNJ Drosophila são conservadas em vertebrados. 4 Portanto, muitos dos os insights aprendeu através de estudos do MNJ Drosophila são aplicáveis à biologia sináptica em todos os seres vivos. Algumas aplicações possíveis incluem o estudo de moléculas envolvidas na orientação dos axônios, doença do neurônio motor, aprendizagem e memória.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
