Summary
Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.
Abstract
Protocol
Başlamadan önce
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: PBT (1X PBS içinde% 0.1 Triton X 100), PBTB (% 0.2 PBT olarak BSA) ve PBTN (2 PBTB% NGS).
- Drosophila larvaları parçalara ayır. Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon bakınız.
İmmünohistokimya
- PBT içeren 1.5 ml tüp larvaları taşıyın. Larvaların PBT 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. Not: yıkamak, bir nutator karıştırıcı 1.5 ml tüp yerleştirin. Pippetor ile sıvı çıkarın ve temiz sıvı ile değiştirin.
- PBT çıkarın. 30 dakika boyunca iki kez PBTB yıkayın.
- PBTB çıkarın. 15 dakika boyunca iki kez PBTN yıkayın.
- 1 saat veya gece boyunca 4 º C'de oda sıcaklığında PBTN içinde seyreltilmesi birincil antikor inkübe edin.
- PBTB iki kez durulayın. Not: eklemek yıkama sıvısı ve hızlı bir şekilde kaldırmak için.
- PBTB 15 dakika için iki kez yıkayın.
- PBTN 30 dakika süreyle yıkayın.
- PBTN içinde seyreltilmiş sekonder antikor (konjuge primer antikor birini kullanıyorsanız) inkübe edin.
- Kalay ve oda sıcaklığında 1,5 saat süreyle inkübe Kapak.
- PBTB iki kez durulayın.
- PBTB ile 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Montaj geçin.
Montaj
Not: örnekleri hemen görüntülü edilecektir gliserol Dağı. Altın Prolong Dağı örnekleri görüntüleme önce saklanabilir (bir haftadan fazla) veya numune birden çok kez görüntülenmiş olması gerekir. Kullanmak için, 2-3 dakika süreyle 65 º C su banyosunda uzatmak bir şişe yerleştirin. Altın Prolong bir kısım atın ve 45-50 º C'de bir ısı bloğu üzerinde tutmak
- PBT bir saat cam vitray preparatlarıyla dökün.
- Işlem için temiz bir cam slayt bazı gliserol koyun.
- Forseps kullanarak bir köşesinde saat camı onları toplama, işleme slayt hayvanların hareket ettirin. Onlar aşağı manikür tarafında olduğundan emin olun.
- Işleme cam slayt taze bir jilet ile baş ve kuyruk çıkarın. # 16 bıçak ile bir exacto-bıçak, bunun için iyi çalışır.
- Başka bir slayt (slayt montaj), gliserol küçük bir damla koymak / temiz forseps ile uzatmak ve yaymak.
- Onlara ters özen, kendi kenarına montaj slayt disseke hayvanların hareket ettirin. Aynı yönde satır mount deneyin. Mount slayt başına 6-8 hayvan.
- Bir kapak kayma Prolong / gliserol bir kenar yerleştirerek ve yavaşça serbest bırakın.
- Tırnak cilası ile slayt Seal. Not [vernik kuruyana kadar görüntü vermeyin. Bu genellikle on dakika sürer. Uzatmak altın monte örnekleri için, slaytlar, mühürleme ya da görüntüleme en az üç saat önce kurumasını bekleyin.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMJ görselleştirme sağlar çünkü immünhistokimyasal (İHK) NMJ biyoloji çalışması için hayati önem taşımaktadır. Bu nöronal membran (örneğin, HRP), presynapse (örneğin, CSP, SYT) ve / veya postsynapse (örneğin, DLG) tanıyan antikorlar kullanılarak yapılır. Sinyal molekülleri, yapısal protein, ya da ilgi roman proteinlerin de lekeli olabilir. Sonra, genler mutasyona uğramış veya missexpressed ve İHK sinaptik yapısı ve / veya nöronal sinyal pertürbasyon tespit edilebilir.
Drosophila NMJ temel yapısı ve işlevi aydınlatılan ilk çalışmalarda bu yana büyük bir popülerlik kazanmıştır. 1-4 Drosophila NMJ çalışmalarda tespit edilmiştir moleküllerin çoğu omurgalılarda muhafaza 4. Bu nedenle, anlayışlar çalışmaları ile öğrendi Drosophila NMJ birçok sistem sinaptik biyoloji için geçerli olabilir. Bazı olası uygulamalar sinaptik geliştirme, plastisite ve nörolojik hastalık yapan moleküllerin çalışma içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
