Summary
यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा की neuromuscular जंक्शन पर synaptic प्रसारण को मापने के लिए electrophysiological विधियों का वर्णन. रिलीज पैदा कृत्रिम मोटर न्यूरॉन axons उत्तेजक द्वारा शुरू की है, और NMJ के माध्यम से संचरण postsynaptic मांसपेशियों में पैदा की प्रतिक्रिया से मापा जा सकता है.
Protocol
शुरू करने से पहले तैयार:
- भटक yhird instar ड्रोसोफिला लार्वा
- HL3.1 समाधान (संशोधित hemolymph तरह)
- Sylgard विच्छेदन (पारदर्शी सिलिकॉन रबर) प्लेटें छोटे (35 x 10 मिमी) प्लास्टिक पेट्री ब्रेंट और McCabe (2008) 3 द्वारा वर्णित विधियों का उपयोग बर्तन में तैयार हैं.
- विच्छेदन पिंस कम कट
- इलेक्ट्रोड pipettes उत्तेजक
- तेज रिकॉर्डिंग pipettes
HL3 समाधान:
- 70 NaCl, 5 KCl, 4 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 Trehalose, 115, sucrose, और 5 HEPES, 7.2 पीएच: dissections और electrophysiological प्रयोगों के दौरान लार्वा HL3.1 2 समाधान है कि मिमी (में) में डूब रहे हैं.
- CaCl 2 की सांद्रता HL3.1 कोशिकी 2 Ca + एकाग्रता की आवश्यकता उपलब्ध कराने के समाधान के लिए जोड़ रहे हैं .
- लारवल dissections कम Ca 2 + (मांसपेशी संकुचन से बचने) सांद्रता HL3.1 का उपयोग कर + .25 मिमी 2 CaCl, बर्फ पर रखा में प्रदर्शन कर रहे हैं .
- Electrophysiological प्रयोगों आमतौर पर HL3.1 में दर्ज कर रहे हैं + 1 मिमी 2 CaCl, लेकिन यह 0.4 से समायोजित किया जा सकता है है - 1 मिमी Ca 2 + के रूप में आवश्यक है.
- HL3.1 समाधान फ़िल्टर उपयोग करने से पहले निष्फल है, और 4 में संग्रहीत ˚ सी.
उत्तेजक और pipettes रिकॉर्डिंग की तैयारी:
- हीट = 390 रेशा, = 4, वेग 35 =, = 200 देरी और = खींचो 0: रिकॉर्डिंग और उत्तेजक pipettes Sutter पी 2000-लेजर आधारित micropipette निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग खींचने के साथ खींच रहे हैं
- उत्तेजक इलेक्ट्रोड पतली दीवारों borosilicate ग्लास capillaries से व्यापक समाप्त होता है कि कटे मोटर axons की चौड़ाई की तुलना में थोड़ा बड़ा थे के साथ तैयार हैं. आकार समाप्त होता है (Narashiga विंदुक पालिशगर का उपयोग) एक चिकनी खत्म, नसों को नुकसान को कम करने के लिए दे firepolished हैं. उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्नान समाधान (HL3.1 + 1 मिमी Ca + 2) के साथ भर रहे हैं .
- रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड 1.2mm borosilicate ग्लास, जो एक तेज विंदुक (3-60 mΩ) फार्म खींच लिया है, और 3M KCl से भरा से तैयार हैं.
भाग 1: ड्रोसोफिला लार्वा के विच्छेदन
- तीसरा instar भटक लार्वा शरीर की दीवार में मांसपेशियों को बेनकाब के रूप में 4 पहले से वर्णित dissected हैं .
- Dissections HL3.1 में प्रदर्शन कर रहे हैं + 0.25 मिमी 2 Ca छोटे सिलिकॉन प्लेटों पर + (35 x 10 मिमी). HL3.1 समाधान dissections के लिए ठंडा हो क्रम में लार्वा चतनाशून्य करना चाहिए और dissections से पहले और दौरान बर्फ पर रखा है.
- लार्वा ब्रेंट और McCabe (2008), इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए 0.25 मिमी जोड़ने 2 Ca + HL3.1 विच्छेदन समाधान करने के लिए, और कम विच्छेदन (~ लंबाई में 2 मिमी) पिंस कि कम कर रहे हैं का उपयोग करके संशोधित किया गया है द्वारा वर्णित विधियों का उपयोग कर विच्छेदित कर रहे हैं एक प्रयोग के दौरान माइक्रोस्कोप उद्देश्य और इलेक्ट्रोड हिट होने की संभावना है.
- विच्छेदन के बाद, लार्वा की मोटर axons कटे हैं. यह धीरे सीएनएस पकड़ और यह थोड़ा ऊपर उठाने है ताकि परिधीय नसों है कि अंदर आना वेंट्रल नाड़ीग्रन्थि के लिए पीछे की मांसपेशियों की मांसपेशियों (चित्रा 1) को नुकसान पहुँचाए बिना काटा जा सकता है है के द्वारा किया जाता है. मस्तिष्क तो निकाल दिया जाता है.
- dissected लार्वा तैयारी HL3.1 के साथ दो बार धोया जाता है + 1 मिमी 2 Ca + .
चित्रा 1 dissected लार्वा मोटर axons काटने में शामिल कदम दिखा योजनाबद्ध. सीएनएस संदंश के साथ उठाया है और मोटर axons मस्तिष्क के आधार पर काट रहे हैं.
भाग 2: लार्वा की मांसपेशी कोशिकाओं से intracellular रिकॉर्डिंग.
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी खुर्दबीन और HL3.1 के साथ प्रस्तुत करने का डूब पर विच्छेदन थाली + 1.5 मिमी Ca + 2 प्लेस और स्नान इलेक्ट्रोड ठीक है तो यह समाधान के साथ संपर्क में है .
- सभी प्रयोगों 6 पेशी पर तीसरे पेट खंड (A3) के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं. परिधीय नसों है कि मांसपेशियों को अंदर आना एक चूषण 5 इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं.
- पहली डिश में उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्थिति कंपन से बचने जब intracellular इलेक्ट्रोड जगह में है. मोटर न्यूरॉन innervating 6 मांसपेशियों के लिए पास के इलाके में उत्तेजक इलेक्ट्रोड प्लेस और कोमल चूषण लागू जब तक कटौती तंत्रिका कांच विंदुक के अंदर है. नसों का खिंचाव नहीं जब चूषण लागू किया जाता है सावधान रहो. थोड़ा तो यह मांसपेशियों और स्थिति यह तो यह कटौती तंत्रिका तंतुओं (चित्रा 2) पर नहीं खींच रहा है नहीं छू रहा है विंदुक उठाएँ.
चित्रा 2. मांसलता और ड्रोसोफिला लार्वा से पेट खंड के innervating मोटर न्यूरॉन्स के एक योजनाबद्ध. उत्तेजक विंदुक और कटे तंत्रिकाओं 6 मांसपेशियों में स्थिति में और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति सचित्र हैं. - इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग तेज एम 3 KCl के साथ भरा microelectrodes के साथ बना रहे हैं. तीसरे पेट खंड (A3) पर 6 की मांसपेशी के केन्द्र से ऊपर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड स्थिति और इनपुट ऑफसेट तो यह स्नान के समाधान के लिए शून्य पढ़ता समायोजित. धीरे धीरे कम इलेक्ट्रोड मांसपेशियों और ऑप्टिकल उच्च आवर्धन के तहत दृष्टिकोण है जब तक यह मांसपेशियों की सतह छू. आस्टसीलस्कप देखो पुष्टि करने के लिए है कि मांसपेशियों penetrated किया गया है. आराम झिल्ली क्षमता से कम से कम -60 एम वी हो सकता है, या चाहिए पशु इस्तेमाल किया जा नहीं करना चाहिए. छिटपुट लघु endplate क्षमता अब दिखाई जानी चाहिए. छोड़ दो सेल करने के लिए रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने से पहले एक मिनट के लिए स्थिर है.
- झिल्ली क्षमता में परिवर्तन एक Axon सिर HS-2A मंच और एक Axoclamp 2B प्रवर्धक के साथ पाया जाता है और Clampex 8.2.0.235 v (Axon उपकरण) के साथ दर्ज है. Axoclamp 2B है कि pCLAMP सॉफ्टवेयर और Digidata 1322A इंटरफ़ेस के साथ संयोजन के रूप में काम करता है चलाता है एक कंप्यूटर को interfaced है.
- कक्ष 3 मिनट के लिए किसी भी उत्तेजनाओं mEJP प्रतिक्रियाओं को मापने के बिना दर्ज किया गया. निशान मिनी विश्लेषण सॉफ्टवेयर (Synaptosoft, v 6.0.3) और mEJP आयाम और आवृत्ति निर्धारित का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया.
तंत्रिका उत्तेजना:
- मोटर न्यूरॉन के कटे अंत एक तीव्रता है कि दोनों मोटर axons के लिए पर्याप्त है, पूरी मांसपेशियों में लगातार प्रतिक्रियाओं का आह्वान है पर वर्ग वोल्टेज दालों (0.3 एमएस अवधि) की एक श्रृंखला के साथ प्रेरित है.
- उत्तेजना मास्टर 8 पल्स जनरेटर है, जो करने के लिए अवधि और अंतराल समय के अनुसार दालों लगातार देने के लिए क्रमादेशित है के साथ उत्पन्न होता है.
- NMJ पर synaptic वसूली के लिए उत्तेजनाओं के बीच पाँच सेकंड की अनुमति दें.
- जब उत्तेजना की ताकत का निर्धारण, कम स्तर के साथ शुरू और तीव्रता कई परीक्षणों में धीरे धीरे वृद्धि. न्यूनतम उत्तेजना तीव्रता है कि पैदा की प्रतिक्रिया में परिणाम प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- जब उचित उत्तेजना तीव्रता तक पहुँच जाता है, वहाँ एक यौगिक EJP और प्रोत्साहन के द्वारा एक पेशी पैदा संकुचन होना चाहिए.
- प्रत्येक मांसपेशी और औसत आयाम से कम से कम 10 पैदा की क्षमता रिकार्ड.
भाग 3: प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 3 6 पेशी से प्रतिनिधि intracellular रिकॉर्डिंग पैदा EJP है दिखा कमानी तंत्रिका की बिजली की उत्तेजना, और छिटपुट लघु endplate क्षमता, या mEJP है के जवाब है. EJP आयाम, गुआंगज़ौ एस के रूप में स्वस्थ जंगली प्रकार, लार्वा के 6 मांसपेशी में आम तौर पर लगभग 40 एम वी और 1-3 mV के बीच mEJP आयाम हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित तरीकों एक अपेक्षाकृत जल्दी और व्यापक NMJ पर synaptic समारोह में परिवर्तन का पता लगाने के लिए रास्ता प्रदान. बरकरार पशुओं का उपयोग vivo में electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, और आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ प्रदर्शन करने की क्षमता, ड्रोसोफिला neurotransmission की शारीरिक और आनुवंशिक पहलुओं की जांच के लिए एक आदर्श पशु मॉडल बनाते हैं.
मांसपेशियों की कोशिकाओं के बाद से बहुत बड़े हैं, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग (TEVC) के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए एक अतिरिक्त कदम जोड़ने के लिए कुछ पसंद हो सकता है. यह जगह में intracellular इलेक्ट्रोड के साथ ही लार्वा तैयारी पर प्रदर्शन किया जा सकता है सेल पर एक इलेक्ट्रोड वर्तमान गुजर स्थिति से. एक बार सेल पर्याप्त वोल्टेज clamped है, वर्तमान प्रतिक्रिया दर्ज किया जा सकता है.
हालांकि 6 मांसपेशियों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अधिक प्रयोग किया जाता है, मांसपेशियों को 7 और 12 भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
तरीकों यहाँ वर्णित Drosophophila NMJ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की अनिवार्य दिखाने तकनीक है कि पहली बार 1976 में जनवरी और जन द्वारा वर्णित किया गया, और बाद synaptic शरीर क्रिया विज्ञान पर शोध के लिए मॉडल प्रणाली हो.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
