ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

Summary

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。

Abstract

このビデオでは、我々は、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部（NMJ）でシナプス伝達を記録するための電気生理学的方法を説明します。幼虫の神経筋システムは、シナプスの生理学と神経伝達の研究のためのモデルのシナプスであり、遺伝学を定義し、実験的操作にアクセスできる状態になっている貴重な研究ツールです。幼虫は、体壁筋肉組織、中枢神経系、および末梢神経を公開するために解剖することができます。ショウジョウバエとその神経支配のパターンの筋肉が十分に特徴付けされていると筋肉が細胞内記録のために簡単にアクセスできます。 A7 - 個々の筋肉は8腹部セグメント、セグメントA2に繰り返されるパターンに配置された30の筋肉と各内での位置や向きによって識別することができます。解剖ショウジョウバエの幼虫は薄いと個々の筋肉と運動ニューロンの軸索の束であると透視可視化することができる

Protocol

準備を開始する前に：

• 放浪yhird齢ショウジョウバエの幼虫
• HL3.1（血リンパのような変更）ソリューション
• Sylgard（透明なシリコーンゴム）ブレントとマッケイブ^（2008）3で説明した方法を使用して、小さな（35 × 10 mm）のプラスチック製のペトリ皿で準備解剖プレート。
• 短い解剖ピンをカット
• 刺激電極のピペット
• シャープ記録ピペット

HL3ソリューション：

1. 70のNaCl、5 KClを、4のMgCl _2、10のNaHCO _3、5トレハロース、115スクロース、および5 HEPES、pH 7.2の：解剖と電気生理学的実験の中で、幼虫は（mMで）含まれているHL3.1溶液²に浸漬されています。
2. CaCl ₂の濃度は、細胞外Ca ^{2 +}の必要な濃度を提供するためにHL3.1溶液に添加されています。
   • 幼虫の解剖はHL3.1を使用して低Ca ^{2 +}濃度（筋肉の収縮を避けるために）+ 0.25 mMのCaCl _2を 、氷上に置きに実行されます。
   • 電気生理学的実験は、通常、HL3.1に記録されます+ 1mMのCaCl _2、しかしこれは、0.4から調整することができます- 1mMのCa ^{2 +は} 、必要に応じて。
3. HL3.1ソリューションは、フィルタ使用前に滅菌し、4℃で保存されます˚C.

ピペットを刺激し、録音の準備：

1. ヒート= 390、フィラメント= 4、速度= 35、= 200を遅延し、= 0をプル：。レコーディングと刺激ピペットは、次の設定を使用してサターP - 2000レーザーベースのマイクロピペットプラーでプルアップされています
2. 刺激電極は切断モーターの軸索の幅よりもわずかに大きくしたワイド端で薄肉ホウケイ酸ガラス毛細管から調製される。形の両端は、神経の損傷を最小限に抑えるために、（Narashigaピペット研磨機を使用して）滑らかな仕上げを与えるためにfirepolishedされています。刺激電極は浴溶液（HL3.1 + 1mMのCa ^{2 +）}ので埋められます。
3. 記録電極は、シャープピペット（mΩの30〜60）を形成するために引っ張られ、3MのKClで満ちている1.2ミリメートルホウケイ酸ガラス、から調製されています。

パート1：ショウジョウバエの幼虫の解剖

1. 三齢放浪幼虫は、以前は次の^4を説明するように体壁の筋肉を公開するために解剖されています。
2. 解剖はHL3.1で実行されます+ 0.25 mMのCa ^{2 +は}小さなシリコンプレート（35 × 10 mm）に。 HL3.1ソリューションは、幼虫をanaesthetizeするために、解剖用の氷冷でなければならず、解剖前と中に氷上に保持されます。
3. 幼虫はHL3.1解剖のソリューションに⁺ 0.25 mMの^{カルシウムを}添加し^ても小さい短い解剖ピン（長さは約2 mm）を用いて電気生理学的実験のために変更されたブレントとマッケイブ（2008）によって記載された方法を用いて切開している実験時の顕微鏡対物と電極をヒットする可能性が高い。
4. 解剖の後、幼虫の運動軸索が切断されています。これは、静かにCNSを保持していると腹側神経節の後方の筋肉を支配する末梢神経が筋肉（図1）を損傷することなく切断することができますので、少しそれを上げることによって行われます。脳はその後削除されます。
5. 解剖幼虫の準備はHL3.1 + 1mMのCa ^{2 +は} 2回洗浄する。

図1。解剖幼虫のモーターの軸索を切断するために必要な手順を示す回路図。 CNSは、鉗子で持ち上げられ、モータの軸索は脳の基底部で切断されています。

パート2：幼虫の筋肉細胞からの細胞内記録。

1. HL3.1と準備は、電気生理学的顕微鏡や水没で解剖のプレートを置き、+それが溶液に接触しているので、1.5mMの^{のCa 2 +}とバス電極を修正。
2. 全ての実験は、サード腹部セグメント（A3）内の筋肉6日に実行されます。筋肉を支配する末梢神経は、吸引電極^5を使用して刺激される。
3. 細胞内電極が所定の位置にあるときに振動を回避するために、皿に刺激電極を配置します。筋肉6を支配する運動ニューロンへのすぐ近くに刺激電極を置き、カットの神経は、ガラスピペット内にあるまで、静かに吸引を適用する。吸引が適用されるときに神経を伸ばすように注意してください。それはカット神経線維（図2）を引っ張っていないので、それが筋肉との位置に触れていないので、少しピペットを上げる。
   
   図2。ショウジョウバエの幼虫から一腹部のセグメントの筋肉や神経支配運動ニューロンの回路図。筋肉6時位置に刺激ピペットや切断神経と記録電極の位置が示されている。
4. イントラ携帯電話の録音は、3 MのKClを充填した鋭い微小電極で作られています。第三腹部セグメント（A3）上筋6の中心上に記録電極を配置し、浴溶液のためのゼロを読み取るように入力オフセットを調整します。それは筋肉の表面に触れるまでゆっくりと高光学倍率の下電極とアプローチ筋肉を下げる。筋肉が侵入されていることを確認するためにオシロスコープをご覧ください。静止膜電位は少なくとも-60 mVのでなければ、または動物を使用しないでください。散発的なミニチュア終板電位が表示されるようになるはずです。記録を開始する前に、1分間安定させるためにセルを残す。
5. 膜電位の変化は、軸索HS - 2AのヘッドステージとAxoclamp 2Bのアンプで検出し、Clampex V 8.2.0.235（アクソンインスツルメンツ）で記録されます。 Axoclamp 2BはpCLAMPソフトウェアとDigidata 1322Aのインタフェースと連携して動作を実行するコンピュータとのインタフェースです。
6. 細胞はmEJP応答を測定するためにあらゆる刺激せずに3分間記録した。トレースは、ミニ解析ソフトウェア（Synaptosoft、V 6.0.3）と決定さmEJP振幅と周波数を用いて分析した。

神経刺激：

1. 運動ニューロンの切断端は、全体の筋肉で一貫性のある反応を引き起こすために、両方のモータの軸索に対して十分な強度で方形電圧パルス（0.3秒持続時間）の連続で刺激される。
2. 刺激が継続的に持続時間と間隔の回数に応じてパルスを提供するためにプログラムされているマスター- 8パルスジェネレータで生成されます。
3. NMJでのシナプスの回復のための刺激の間に5秒を許可する。
4. 刺激の強さを決定する際に、最も低い水準で始まり、いくつかの臨床試験を介して徐々に強度を増加させる。誘発反応の結果、最小の刺激強度は実験で使用する必要があります。
5. 適切な刺激強度に達したときに、一つの化合物のEJPと刺激によって誘発one筋肉の収縮があるはずです。
6. 各筋肉と平均振幅から少なくとも10誘発電位を記録する。

パート3：代表的な結果

図3。誘発EJPのを示す筋肉6日から代表的な細胞内記録では、分節神経の電気刺激、および散発ミニチュア終板電位、またはmEJPのへの応答です。このようなカントンSのような健康な野生型幼虫の筋肉6のEJPの振幅は、通常は約40 mVのと1-3 mVの間mEJP振幅です。

Discussion

方法はNMJにおいてシナプス機能の変化を検出するために、比較的迅速かつ広範な手段を提供するここで説明する。 in vivoでインタクトな動物を用いて電気生理学的記録を実行し、遺伝的または薬理学的操作を実行する機能は、ショウジョウバエ神経伝達の生理的および遺伝的側面を調査するための理想的な動物モデルにします。

筋細胞は非常に大きいので、いくつかの2つの電極電圧クランプ（TEVC）記録のためにこのプロトコルに追加のステップを追加することを好むかもしれません。これは、セルの現在のパッシング電極を配置することにより、場所の細胞内電極と同一の幼虫の準備を行うことができます。セルが固定十分に電圧になると、電流応答を記録することができます。

筋肉6が最も一般的な電気生理学的記録のために使用されていますが、筋肉7と12を使用することもできます。

1976年月と月によって記述された技術を、そして以来、シナプス生理学を研究するためのモデルシステムとなっている - ここで説明する方法はDrosophophila NMJ電気生理学の要点を示す。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Petri dishes (35 x 10 mm)	BD Biosciences	1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097366-1004
Dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	475002-9902
Light for microscope	Schott AG	KLI500
Dissection pins	Fine Science Tools	26002-10
pClamp 9 software	Molecular Devices	PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-0
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-2000
Pipette polisher	Narishige International	MF-83
Axon HS-2A head stage	Molecular Devices	Model HS-2A
Micromanipulators	Sutter Instrument Co.	MP-85
Axoclamp 2B amplifier	Molecular Devices	AXOCLAMP 2B
Clampex Software	Molecular Devices	v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3	Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier	Brownlee	Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	Sigma-Aldrich	p-9333
NaHCO3	Sigma-Aldrich	s6297-1kg
Trelahose	Sigma-Aldrich	TO167
Sucrose	Fisher Scientific	bp220-212
HEPES	Sigma-Aldrich	h-3375
MgCl-6H2O	Sigma-Aldrich	m2670-1kg
CaCl2	Fisher Scientific	c79-500
Master-8 Pulse Generator	A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up	Technical Manufacturing Corp.
Faraday Cage