Summary
Здесь мы опишем электрофизиологические методы измерения синаптической передачи в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Вызванные релиз инициируется искусственно стимулируя двигательных нейронов аксоны, и передачу по NMJ можно измерить с помощью постсинаптического ответа вызвало в мышцах.
Abstract
В этом видео мы описываем электрофизиологические методы регистрации синаптической передачи в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинки дрозофилы. Личиночная система нервно-мышечной является модель синапсов для изучения физиологии и синаптической нейротрансмиссии, и является ценным инструментом исследований, которые определил генетики и доступна для экспериментальных манипуляций. Личинки можно разрезать, чтобы разоблачить стенки тела мускулатуре, центральной нервной системы, и периферических нервов. Мышцах дрозофилы и их иннервации картина хорошо охарактеризованы и мышцы легко доступны для внутриклеточной регистрации. Индивидуальные мышц можно определить по их расположения и ориентации в 8 брюшных сегментов, каждый из 30 мышц, расположенных в шаблон, который повторяется в сегментах A2 - A7. Расчлененный дрозофилы личинки тонкие и отдельных мышц и связок двигателя аксонов нейронов могут быть визуализированы на просвечивание
Protocol
Перед началом приготовления:
- Блуждающие yhird возраста личинок дрозофилы
- HL3.1 (модифицированный гемолимфы-подобных) решение
- Sylgard (прозрачная силиконовая резина) пластин рассечение подготовлен в небольшом (35 х 10 мм) пластиковых чашках Петри используя методы, описанные Брентом и МакКейб (2008) 3.
- Вырезать рассечение контакты короткий
- Стимулирование электрода пипетки
- Sharp пипетки записи
HL3 Решение:
- Во время вскрытия и электрофизиологических экспериментов, личинки погружаются в HL3.1 раствора 2, который содержит (в мм): 70 NaCl, KCl 5, 4 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 трегалозу, 115 сахарозы и 5 HEPES, рН 7,2.
- Концентрации CaCl 2 добавляются HL3.1 решение для обеспечения требуемой концентрации внеклеточного Са 2 +.
- Личинки вскрытия проводятся при низких Са 2 + концентрации (во избежание сокращения мышц), используя HL3.1 + 0,25 мМ CaCl 2, держится на льду.
- Электрофизиологические эксперименты, как правило, записываются в HL3.1 + 1 мМ CaCl 2, но это может быть в диапазоне от 0,4 - 1 мМ Ca 2 + по мере необходимости.
- HL3.1 решение фильтр стерилизовать перед использованием, и хранили при 4 ˚ C.
Подготовка стимулирования и записи пипетки:
- Запись и стимулирующие пипетки тянут с Саттер P-2000 Лазерная съемник микропипетки, используя следующие параметры: Тепло = 390, накаливания = 4, скорость = 35, Delay = 200 и Вытяните = 0.
- Стимулирующие электроды изготавливаются из тонкостенных капилляров боросиликатного стекла с широкими концами, которые были немного больше, чем ширина разорвала аксонов двигателя. Формы концы firepolished дать гладкой поверхностью (с помощью пипетки Narashiga полировки), чтобы свести к минимуму повреждения нерва. Стимулирующие электроды заполнены с ванной решение (HL3.1 + 1 мМ Ca 2 +).
- Запись электроды изготовлены из боросиликатного стекла 1.2 мм, которая тянется к форме резкого пипетки (30-60 мОм), и наполнены 3M KCl.
Часть 1: Препарирование личинки дрозофилы
- Третьего возраста блуждающих личинки расчлененный подвергать мышцы в стенке тела, как описано выше 4.
- Вскрытия проводятся в HL3.1 + 0,25 мМ Са 2 + на небольшие пластины силиконовые (35 х 10 мм). HL3.1 решение должно быть ледяным для вскрытия в целях анестезировать личинки, и она хранится на льду до и во время вскрытия.
- Личинки расчлененный используя методы, описанные Брентом и МакКейб (2008), то есть изменение для экспериментов электрофизиологии, добавив 0,25 мМ Ca 2 + до HL3.1 рассечение решение, и с помощью коротких контактов рассечение (~ 2 мм в длину), которые являются менее вероятно, ударил микрообъектива и электродов во время эксперимента.
- После вскрытия двигателя аксонов личинки разорваны. Это можно сделать, мягко проведение ЦНС и повышения ее немного, таким образом периферических нервов, иннервирующих мышцы задней до брюшного ганглия могут быть сокращены без ущерба для мышц (рис. 1). Мозг затем удаляются.
- Расчлененный личиночной препарата дважды промывают HL3.1 + 1 мМ Ca 2 +.
Рисунок 1. Схематическое изображение этапов резки двигателя аксонов расчлененный личинок. ЦНС снимается пинцетом и двигателя аксоны Срез у основания головного мозга.
Часть 2: Внутриклеточные записи из личиночных клеток.
- Место вскрытия пластину на микроскоп электрофизиологии и погрузиться приготовительный с HL3.1 + 1,5 мМ Са 2 + и исправить ванны электродом так она находится в контакте с раствором.
- Все эксперименты проводятся на мышечную 6 в третий сегмент брюшка (A3). Периферических нервов, иннервирующих мышцы стимулируются использованием всасывающего электрода 5.
- Позиция стимулирующего электрода в первые блюда, чтобы избежать вибрации, когда внутриклеточный электрод на место. Место стимулирующих электродов в непосредственной близости от мотонейрона, иннервирующих мышцы 6 и применять нежные всасывания до сократить нерв находится внутри стеклянной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не растягивать нервы, когда всасывающий применяется. Поднимите пипеткой немного, так что не касается мышц и положение его, чтобы он не тянет на разрезе нервных волокон (рис. 2).
Рисунок 2. Схема мускулатуры и иннервирующих моторных нейронов одного сегмента брюшка от личинки дрозофилы. Положение стимулирует пипетки и разорвал нервов и записи электрода в позиции на мышцы 6, показано на рисунке. - Intraсотовые запись производится с острыми микроэлектродов заполнены 3 М KCl. Позиция записи электрода над центром мышц 6 на третий сегмент брюшка (A3) и отрегулировать входной информации таким образом это читает нулю для ванны решение. Медленно опустите электрод и подход мышц под высоким оптическим увеличением до касания поверхности мышц. Часы осциллограф для подтверждения того, что мышца была проникли. Мембранный потенциал покоя должна быть не менее -60 мВ, или животное не должно использоваться. Спорадические миниатюрных потенциалов концевой пластинки теперь должна быть доступна. Оставьте ячейки стабилизироваться в течение одной минуты, прежде чем начать запись.
- Изменения мембранного потенциала регистрировались Axon HS-2А стадии голову и Axoclamp усилителя 2B и записывался с CLAMPEX V 8.2.0.235 (Axon Instruments). 2B Axoclamp сопряжено с компьютером, который работает pCLAMP программного обеспечения и работает совместно с интерфейсом DIGIDATA 1322A.
- Клетки были записаны в течение 3 минут без каких-либо стимулов для измерения mEJP ответов. Следы были проанализированы с помощью мини программного обеспечения для анализа (Synaptosoft, V 6.0.3) и mEJP амплитудой и частотой, определяемой.
Нервные стимуляция:
- Разорвала конце двигательных нейронов стимулируется ряд прямоугольных импульсов напряжения (0,3 мс) на интенсивность, достаточную для аксонов двигателя, чтобы вызвать последовательных мер в целом мышцы.
- Стимулом формируется с мастер-8 генератор импульсов, который запрограммирован для доставки импульсы непрерывно в зависимости от продолжительности и интервала времени.
- Разрешить пять секунд между стимулами для восстановления синаптической на NMJ.
- При определении силы раздражителя, начните с самого низкого уровня и повысить интенсивность медленно, в течение нескольких судебных разбирательств. Минимальная интенсивность стимула, который приводит к вызвала реакция должна быть использована в экспериментах.
- При соответствующей интенсивности стимула будет достигнута, должен быть один EJP соединения и один мышечных сокращений вызвана стимул.
- Запись по крайней мере 10 вызванных потенциалов от каждой мышцы и средней амплитудой.
Часть 3: Представитель Результаты
Рисунок 3. Представителю внутриклеточной регистрации из мышечной 6 показывает вызвала EJP является ответ на электрическую стимуляцию сегментарные нервы, и спорадические миниатюрных потенциалов концевой пластинки, или mEJP в. EJP амплитуд в мышцах 6 здорового дикого типа личинок, такие, как Кантона S, как правило, около 40 мВ и mEJP амплитуды между 1-3 мВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, обеспечивают относительно быстрый и широкий путь для обнаружения изменений в синаптической функции в NMJ. Способность выполнять электрофизиологические записи на основе интактных животных в естественных условиях, а также выполнять генетические или фармакологических манипуляций, чтобы дрозофилы идеальная модель животного для исследования физиологических и генетических аспектов нейротрансмиссии.
Так как мышечные клетки очень большие, некоторые, возможно, предпочтут, чтобы добавить дополнительный шаг к этому протоколу в течение двух электродов напряжение зажим (TEVC) записи. Это может быть выполнена на той же личиночной препарат с внутриклеточным электродом в месте, размещая текущий обход электрода на ячейку. Как только клетка достаточно напряжения зажат, текущий ответ может быть записан.
Хотя мышцы 6 является наиболее часто используется для записи электрофизиологии, мышцы 7 и 12 также может быть использован.
Методы, описанные здесь, показывают основы Drosophophila NMJ электрофизиологии - методы, которые были впервые описаны Ян и Ян в 1976 году, и с тех пор стали модельная система для исследования синаптических физиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
