Summary
Hier tonen we de fabricage van op basis van collageen, weefsel constructen die het skelet myoblasten. Deze 3-D ontworpen constructies kunnen worden gebruikt om weefsels te vervangen of repareren
Abstract
Ondanks het feit dat elektronische pacemakers zijn levensreddende medische hulpmiddelen, hun prestaties op lange termijn bij pediatrische patiënten kan problematisch zijn als gevolg van de beperkingen die worden opgelegd door kleine een kind grootte en hun onvermijdelijke groei. Bijgevolg is er een werkelijke behoefte aan innovatieve therapieën die specifiek ontworpen voor pediatrische patiënten met hartritmestoornissen. Wij stellen voor dat een geleidende biologisch alternatief dat bestaat uit een op basis van collageen matrix die autologously-afgeleide cellen beter kunnen aanpassen aan de groei, verminderen de noodzaak voor terugkerende operaties, en sterk verbeteren van de kwaliteit van leven voor deze patiënten. In de huidige studie beschrijven we een procedure voor het opnemen van de primaire skelet myoblast cel culturen binnen een hydrogel matrix van de mode een chirurgisch-implanteerbare weefsel te bouwen dat zal dienen als een elektrische leiding tussen de bovenste en onderste kamers van het hart. Uiteindelijk verwachten we gebruik van dit type van gemanipuleerde weefsel aan atrioventriculaire elektrische geleiding te herstellen in kinderen met een compleet hartblok. In het licht van dat, we isoleren myoblasten van de skeletspieren van neonatale Lewis ratten en plaat ze op laminine-coated weefselkweek gerechten met een aangepaste versie van vastgestelde protocollen
Protocol
Deel 1: Monteer de bouw gietmallen
- Gebruik een scheermesje met silicone (VWR) te halveren en het snijd ze in 3 cm lange stukken.
- Plaats een druppel van implantaat-grade RTV silicone lijm (Rhodia) op de binnenkant van elk uiteinde van de slang.
- Plaats snel een klein stukje (1 cm x 1 cm) van polyester mesh (McMaster-Carr) op de silicone lijm te laten vallen en af te stemmen op het uiteinde van de slang. Dit zal een licht verhoogd en vlakke ondergrond voor de bouw van bevestiging. Herhaal dit voor het andere uiteinde.
- Laat de mal bij kamertemperatuur drogen gedurende 3 dagen. Het is nuttig tot 20 à 30 mallen te maken op een moment, omdat deze in wezen voor eenmalig gebruik.
- Zodra de lijm volledig droog is, bewaar deze mallen in een bekerglas gevuld met 70% ethanol totdat ze nodig zijn. Deze stap zal helpen Steriliseer de mallen en het eindproduct is weergegeven in figuur 1.
Deel 2: Voorbereiding voor myoblast celisolatie
- Verdun 1 mg Laminine (Sigma) in 250 ml 0,22 um filter-gesteriliseerd fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline / streptomycine (Invitrogen) en 1% fungizone (Invitrogen).
- Coat 150 mm kultuurplaten (BD Falcon) met 4 ml van de verdunde oplossing van Laminine stap 1,1 en incuberen bij 37 º C gedurende ten minste 4 uur voor beplating van de primaire skelet myoblasten.
- Maak de myoblast medium door het mengen van Ham's F-10 voedingsstoffen Mengsel (Sigma) met 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L basic fibroblast groeifactor (Promega), 1% penicilline / streptomycine (Invitrogen), en 1% fungizone ( Invitrogen).
- Bereid de skeletspieren spijsvertering oplossing door het oplossen van 1 g van ~ 295 U / mg Collagenase 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / mL Dispase-2 (Roche). Voeg 0,037 g CaCl 2 en meng goed. Filter steriliseren de spijsvertering buffer met behulp van een 0,2 um filter schijf gemonteerd op een 10 ml spuit en op te slaan porties bij -20 ° C. Plaats de hoeveelheid die nodig is voor het weefsel spijsvertering bij 37 ° C, samen met de myoblast media.
Deel 3: myoblast isolatie van skeletspieren
- Met behulp van een tang en kleine scharen, verwijder paraspinale spieren van dode neonatale Lewis ratten door het snijden van de rug langs het ruggenmerg, peeling de rug van de huid en fascia lagen en vervolgens weg te snijden van de spieren.
- In een weefselkweek kap, plaats de uitgesneden spieren in een 50 ml conische buis (BD Falcon) gevuld met 40 ml 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) op ijs. Laat de spier strips om zich te vestigen op de bodem van de buis en voorzichtig het grootste deel van de vloeistof en bloed overblijfselen door een vacuüm zuigen verwijderen met een steriel Pasteur pipet in een cultuur kap (Baker).
- Giet de geoogste spier stukken op een 150 mm cultuur schaal en haal zo veel van de resterende vloeistof mogelijk met afzuiging. Met behulp van twee single-randen scheermesjes gehakt het weefsel tot een dikke pasta. Giet voorverwarmde vertering oplossing op de pasta en breng het mengsel op een verse 50 ml buis met behulp van een pipet van 10 ml. Tijdens de enzymatische vertering, is het weefsel af en toe getritureerd (zonder bubbelen), met een 10 ml pipet gemonteerd op een draadloze Pipette-Aid (Drummond). Nogmaals, laat het weefsel om zich te vestigen en verwijder de overtollige vloeistof.
- Plaats de buis op een schommelende platform en verteren bij 37 º C gedurende ongeveer 30 minuten.
- Zodra de spier wordt vloeibaar gemaakt, laat de oplossing door een 70 um cel zeef (BD Falcon) en gecentrifugeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 600 xg (Beekman GP). Met een Pasteur pipet en zuig, verwijder zoveel mogelijk van de vloeistof als mogelijk en resuspendeer de pellet met 10 ml warm myoblast medium.
- Pre-bord van de cellen op een ongecoate 150 mm weefselkweek plaat gedurende 15 minuten te helpen verwijderen fibroblasten.
- Breng de cellen die nog niet zijn aangesloten op de laminine-gecoate cultureware en verdunnen zodat er een plaat voor elke 1 tot 2 ratten pups. Plaats de plaat in een vochtige incubator ingesteld op 37 ° C met 5% CO 2.
Deel 4: Casting ontworpen weefsel constructen (5 ml)
- Na 1 tot 2 dagen, verwijdert u 10 van de 150 mm myoblast weefselkweek platen uit de couveuse, tweemaal spoel ze met 37 ° C 1X PBS en voeg 4 ml warme 0,05% trypsine-EDTA voor elk bord. Zet de platen om de incubator gedurende 5 minuten.
- Oogst de vrijstaande myoblasten van de platen in de cultuur motorkap en het verzamelen van de vloeistof in een 50 ml buis (BD Falcon). Gebruik 10 ml myoblast medium om alle van de platen spoelen en dit te combineren met de cellen in de centrifugebuis. Pellet de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 600 xg (Beckman GP) en verwijder overtollige vloeistof zoals beschreven in stap 3.5.
- Resuspendeer de myoblast cellen in 1,6 ml myoblast medium en leg ze op ijs.
- Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig 4 construeren mallen uit stap 1,5 en twee keer spoel ze af met 1X PBS. Afzuiging korting op alle sporen van PBS met een Pasteur pipet voor het plaatsen van elke vorm in een 6-well weefsel culture plaat (BD Falcon).
- Verzamel de andere reagentia die nodig zijn voor de bouw van de voorbereiding (10x Ham's F10, antibiotica, type 1 collageen [3,9 mg / ml] [6] en Matrigel ™) op ijs en houd myoblast media bij 37 º C. Combineer 500 pL 10x Ham's F10, 100 ul penicilline / streptomycine, 100 ul fungizone, 1,6 ml collageen, en 750 ul Matrigel ™ in een 15 ml conische buis. Meng de oplossing voor 10 sec met behulp van een Mini-Vortexer (VWR) ingesteld op 10 en op ijs.
- Voeg vervolgens 80 pi van NaHCO 3 en de myoblast schorsing van stap 3.3 toe aan het mengsel van stap 3.5. Vortex het gehele mengsel voor 10 sec en terug de buis om het ijs emmer voor een paar minuten aan de oplossing van de bubbels.
- Voorzichtig wierp het mengsel in de vormen voordat het begint te stollen met behulp van een pipet van 10 ml. Elke vorm houdt ongeveer 1 ml van de stroperige vloeistof. Probeer te voorkomen dat er luchtbellen tijdens deze procedure.
- Breng voorzichtig de plaat met de cast bouwt aan de incubator. Na ~ 30 minuten, verwijder de gestolde construeert uit de incubator en zorgvuldig myoblast medium toe te voegen aan elke well ter dekking van het weefsel te bouwen. Zet de plaat in de broedstoof (figuur 2).
Deel 5: Representatieve resultaten
Wanneer dit protocol juist wordt uitgevoerd, de myoblast-bevattende weefsel construct is klaar voor de in vivo implantatie (dwz wanneer verwijderd uit de matrijs) of voor verdere in-vitro-analyses na 2 dagen.
Figuur 1. Voorbeelden van voltooide bouw van mallen (zie stap 1.5).
Figuur 2. Een gestolde myoblast-die weefsel te bouwen [1].
Figuur 3. H & E gekleurde coupes van een myoblast-bevattende weefsel te bouwen. "A" toont een langsdoorsnede en "B" toont een dwarsdoorsnede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mallen waarin het weefsel te bouwen zullen worden geworpen kan worden gemaakt in elke gewenste vorm en grootte, maar er moet ten minste twee punten van bevestiging. Anders, de matrix en cellen vormen een bolvormige structuur en de cellen sterven. In het huidige protocol beschrijven we het gebruik van een polyester mesh voor dit doel, maar we hebben ook met succes gebruikt roestvrij staal gaas. Uiteraard zal grotere vormen vereisen meer cellen en een groter volume van de andere ingrediënten. Bij het maken van de mallen, is het belangrijk om de hoeveelheid siliconen lijm gebruikt te minimaliseren en om ervoor te zorgen dat het ligt aan de uiteinden van de buizen. Dit komt omdat myoblasten de buurt van de lijm vaak niet levensvatbaar, zelfs na enkele dagen genezen. Daarnaast is het verstandig om het bord van de myoblasten voor slechts een dag of twee voordat de voorbereiding van het weefsel construeert als vervuilende fibroblasten zal zich snel vermenigvuldigen en uiteindelijk overweldigen de myogene componenten van de cultuur. Ook moet myoblasten niet dicht worden verzilverd, omdat cellen in contact met elkaar begint te smelten en in myotubes differentiëren. Met betrekking tot de fabricage van het weefsel constructies, zijn er een aantal commercieel beschikbare bronnen van type 1 collageen, maar elk tonen de verschillen in de mate van stolling en de consistentie van het eindproduct. Bovendien is het essentieel dat het collageen preparaat niet wordt bestraald met UV-licht, omdat dit proces remt de gelering proces. In onze handen, de constructen van kleur veranderen van een donker roze tot een licht roze tijdens het stollen. Tot slot, onze collageen voorbereiding is zuur-solublized (niet pepsine verteerd), zodat de pH van het mengsel in stap 3.5 dient te worden verhoogd door het toevoegen van NaHCO 3 voor de integratie van de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Children's Hospital Boston in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (HL068915, HL088206), een nieuwe onderzoeker Award van de Thrasher Research Fund, en bijdragen aan het hartgeleiding Fonds op Children's Hospital Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
