Summary
यहाँ, हम कोलेजन आधारित है, ऊतक कंकाल myoblasts युक्त constructs के निर्माण को प्रदर्शित करता है. ये 3 - डी इंजीनियर constructs जगह या ऊतकों की मरम्मत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
Abstract
तथ्य यह है कि इलेक्ट्रॉनिक पेसमेकर के बावजूद जीवन बचत चिकित्सा उपकरणों, उनके बाल चिकित्सा रोगियों में लंबी अवधि के प्रदर्शन में एक बच्चे के छोटे आकार और उनके अपरिहार्य वृद्धि द्वारा लगाए गए प्रतिबंधों के लिए समस्याग्रस्त कारण हो सकते हैं. नतीजतन, वहाँ अभिनव कार्डियक ताल विकारों के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के लिए विशेष रूप से डिजाइन उपचार के लिए एक वास्तविक जरूरत है. हम प्रस्ताव है कि एक प्रवाहकीय जैविक एक कोलेजन आधारित युक्त मैट्रिक्स से मिलकर वैकल्पिक autologously व्युत्पन्न कोशिकाओं को बेहतर विकास के लिए अनुकूल है, आवर्तक सर्जरी के लिए की जरूरत को कम सकता है, और बहुत इन रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार. वर्तमान अध्ययन में, हम एक hydrogel मैट्रिक्स के भीतर प्राथमिक कंकाल myoblast सेल संस्कृतियों को शामिल फैशन के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण ऊतकों का निर्माण है कि दिल के ऊपरी और निचले कक्षों के बीच एक विद्युत नाली के रूप में काम करेगा करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. अंततः, हम इंजीनियर ऊतक के इस प्रकार का उपयोग कर पूरा दिल ब्लॉक के साथ बच्चों में atrioventricular विद्युत प्रवाहकत्त्व को बहाल करने की आशा. उस के ध्यान में रखते हुए, हम नवजात चूहों लुईस और उन्हें को laminin लेपित टिशू कल्चर स्थापित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण का उपयोग व्यंजन पर थाली के कंकाल की मांसपेशियों से myoblasts अलग
Protocol
भाग 1: molds कास्टिंग निर्माण इकट्ठा
- एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग (VWR) आधा और यह 3 सेमी लंबे टुकड़ों में काट.
- टयूबिंग के प्रत्येक के अंत के अंदर पर प्रत्यारोपण ग्रेड RTV सिलिकॉन चिपकने वाला (Rhodia) की एक बूंद प्लेस.
- जल्दी पॉलिएस्टर जाल का एक छोटा सा (1 सेमी x 1 सेमी) सिलिकॉन चिपकने वाला ड्रॉप पर (McMaster कार्र) टुकड़ा जगह और टयूबिंग के अंत के साथ संरेखित करें. यह निर्माण अनुलग्नक के लिए एक थोड़ा उठाया और फ्लैट सतह प्रदान करेगा. दूसरे छोर के लिए दोहराएँ.
- ढालना कमरे के तापमान पर 3 दिनों के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. यह उपयोगी है एक समय में 20 से 30 नए नए साँचे बनाने के रूप में इन अनिवार्य रूप से प्रयोज्य हैं.
- एक बार पूरी तरह से सूखे चिपकने वाला है, 70% इथेनॉल के साथ भरा बीकर में इन molds के दुकान जब तक वे की जरूरत है. यह कदम बाँझ नए नए साँचे में मदद मिलेगी और समाप्त उत्पाद चित्र 1 में दिखाया गया है.
भाग 2: myoblast सेल अलगाव के लिए तैयार
- 250 में 1 मिलीग्राम laminin (सिग्मा) पतला एमएल 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर निष्फल फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस)% एक पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen) और 1% Fungizone (Invitrogen) युक्त.
- कोट 1.1 कदम से पतला laminin समाधान के 4 एमएल और कम से कम 4 घंटे के लिए 37 º सी में पहले प्राथमिक कंकाल myoblasts चढ़ाना सेते के साथ 150 मिमी टिशू कल्चर प्लेटें (बी फाल्कन).
- 20% (अटलांटा बायोलॉजिकल) FBS, 5 एनजी / एल बुनियादी fibroblast वृद्धि फैक्टर (Promega), 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen), और 1% Fungizone के साथ है हाम F-10 पोषक तत्व मिश्रण (सिग्मा) के मिश्रण से myoblast मध्यम ( Invitrogen).
- ~ 295 / यू मिलीग्राम 2 Collagenase (वर्दिग्टन) 100 एमएल 2.4 U / एमएल Dispase-2 (Roche) में 1 ग्राम भंग करके कंकाल की मांसपेशी पाचन समाधान तैयार करें. .037 छ 2 CaCl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 एमएल सिरिंज और दुकान aliquots पर फिट डिस्क का उपयोग करके पाचन बफर बाँझ फ़िल्टर 37 में ऊतक डिग्री सेल्सियस myoblast मीडिया के साथ पाचन के लिए आवश्यक राशि प्लेस.
भाग 3: कंकाल की मांसपेशी से Myoblast अलगाव
- संदंश और छोटे कैंची का प्रयोग, मृत नवजात चूहों लुईस से वापस नीचे रीढ़ की हड्डी के साथ टुकड़ा करने की क्रिया, वापस त्वचा और प्रावरणी परतें छीलने और फिर मांसपेशियों excising द्वारा paraspinal मांसपेशियों को दूर.
- एक टिशू कल्चर हुड में 50 एमएल शंक्वाकार (बी फाल्कन) ट्यूब 1X हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान के 40 एमएल (HBSS) बर्फ (Invitrogen) के साथ भर में excised मांसपेशियों जगह है. मांसपेशियों स्ट्रिप्स ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए और ध्यान से एक बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ एक संस्कृति हुड (बेकर) में वैक्यूम चूषण द्वारा तरल और रक्त के अवशेष के सबसे हटायें दें.
- एक 150 मिमी संस्कृति डिश पर काटा मांसपेशियों टुकड़े डालो और शेष तरल के रूप में चूषण के साथ संभव के रूप में ज्यादा हटा. 2 एकल धार रेज़र ब्लेड का प्रयोग एक मोटी पेस्ट करने के लिए ऊतक कीमा. पेस्ट पर पूर्व गर्म पाचन समाधान डालो और मिश्रण एक ताजा 50 एमएल 10 एमएल पिपेट का उपयोग ट्यूब के लिए स्थानांतरण. Enzymatic पाचन के दौरान, ऊतक कभी कभी एक 10 एमएल ताररहित पिपेट सहायता (Drummond) पर फिट विंदुक के साथ है triturated बुदबुदाती (बिना). फिर, ऊतक बसने और अतिरिक्त तरल निकालने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक घोड़ा मंच पर ट्यूब प्लेस और के बारे में 30 मिनट के लिए 37 º सी में पचाने में.
- एक बार मांसपेशियों तरलीकृत है, एक 70 सुक्ष्ममापी सेल (बी फाल्कन) झरनी और अपकेंद्रित्र के माध्यम से कमरे के तापमान पर 600 XG (Beckman जीपी) पर 10 मिनट के लिए समाधान से गुजारें. पाश्चर विंदुक और चूषण के साथ, के रूप में तरल के जितना संभव हटाने और गर्म myoblast माध्यम के 10 एमएल के साथ गोली resuspend.
- प्री - प्लेट एक uncoated 15 मिनट के लिए 150 मिमी टिशू कल्चर थाली पर कक्षों fibroblasts हटाने में मदद करने के लिए.
- कोशिकाओं है कि अभी तक laminin-लेपित cultureware के लिए संलग्न नहीं है और इतना पतला है कि वहाँ हर 1 से 2 चूहे पिल्ले के लिए एक थाली है स्थानांतरण. Humidified इनक्यूबेटर सेट में 37 2 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ पर थाली प्लेस .
भाग 4: कास्टिंग इंजीनियर ऊतक constructs (5 एमएल)
- 1 से 2 दिनों के बाद, 10 150 मिमी से myoblast टिशू कल्चर इनक्यूबेटर प्लेटें निकालने के लिए, उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस 1X पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला, और प्रत्येक थाली करने के लिए गर्म 0.05% trypsin EDTA के 4 एमएल जोड़ें. इनक्यूबेटर करने के लिए 5 मिनट के लिए प्लेटें लौटें.
- संस्कृति के हुड में प्लेटों से अलग myoblasts हार्वेस्ट और एक 50 एमएल ट्यूब में तरल (बी फाल्कन) इकट्ठा. Myoblast माध्यम के 10 एमएल का प्रयोग प्लेटों के सभी कुल्ला और अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं के साथ इस गठबंधन. गोली 600 XG (Beckman जीपी) पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं और अतिरिक्त तरल निकालने 3.5 चरण में वर्णित के रूप में.
- Myoblast और बर्फ पर मध्यम जगह 1.6 एमएल में myoblast कोशिकाओं Resuspend.
- संदंश का प्रयोग, ध्यान से 1.5 कदम से 4 molds के निर्माण को हटाने और उन्हें 1X पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला. पाश्चर विंदुक के साथ पीबीएस के सभी निशान से 6 अच्छी तरह से ऊतक घन में प्रत्येक ढालना रखने से पहले वैक्यूम चूषणLTURE प्लेट (बी फाल्कन).
- बर्फ पर अन्य निर्माण की तैयारी के लिए आवश्यक अभिकर्मकों (10X हाम F10, एंटीबायोटिक दवाओं, टाइप 1 कोलेजन [3.9 मिलीग्राम / एमएल] [6] और Matrigel ™) को इकट्ठा और 37 º सी. पर myoblast मीडिया रखने 500 μL 10X हाम F10, 100 μL पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 μL Fungizone, 1.6 एमएल कोलेजन, और एक 15 एमएल चोटीदार ट्यूब में 750 μL Matrigel ™ का मिश्रण. 10 सेकंड (VWR) मिनी Vortexer 10 के लिए सेट और जगह पर बर्फ का उपयोग कर समाधान के लिए मिक्स.
- अगले, मिश्रण को 3.5 कदम से 3 NaHCO के 80 μL और 3.3 कदम से myoblast निलंबन जोड़ने. 10 सेकंड के लिए पूरे मिश्रण भंवर और बुलबुले के समाधान को साफ करने के लिए कुछ मिनट के लिए बर्फ बाल्टी ट्यूब वापसी.
- Molds में मिश्रण ध्यान डाली से पहले यह करने के लिए एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग जमना शुरू होता है. प्रत्येक मोल्ड चिपचिपा तरल के लगभग 1 एमएल का आयोजन करेगा. इस प्रक्रिया के दौरान हवाई बुलबुले को शुरू करने से बचने की कोशिश करें.
- ध्यान इनक्यूबेटर कलाकारों constructs युक्त थाली हस्तांतरण. ~ 30 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से जम constructs हटाने और ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह myoblast मध्यम जोड़ने के लिए कवर ऊतक का निर्माण. इनक्यूबेटर (चित्रा 2) के लिए थाली लौटें.
भाग 5: प्रतिनिधि के परिणाम
जब इस प्रोटोकॉल ठीक से मार डाला है, ऊतक का निर्माण myoblast युक्त vivo आरोपण के लिए तैयार है (यानी जब मोल्ड से हटाया) या 2 दिनों के बाद इन विट्रो विश्लेषण में आगे के लिए.
पूरा निर्माण molds के चित्रा 1 उदाहरण (1.5 चरण देखें).
चित्रा 2. जम myoblast युक्त ऊतक [1] का निर्माण.
चित्रा 3. Myoblast युक्त एक ऊतक के एच एंड ई दाग वर्गों का निर्माण . एक अनुदैर्ध्य खंड 'ए' दर्शाया गया है और "बी" एक पार अनुभाग से पता चलता है.
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Discussion
नए नए साँचे में जो ऊतकों का निर्माण डाली जाएगा किसी भी आकार और आकार में बनाया जा सकता है है, तथापि, वहाँ करने के लिए अनुलग्नक के कम से कम दो अंक की जरूरत है. अन्यथा, मैट्रिक्स कोशिकाओं और एक गोलाकार संरचना के रूप में और कोशिकाओं को मरने. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम इस उद्देश्य के लिए एक पॉलिएस्टर जाल के उपयोग का वर्णन, अभी तक हम भी सफलतापूर्वक स्टेनलेस स्टील जाल का इस्तेमाल किया. जाहिर है, बड़ा molds के अधिक कक्षों और अन्य सामग्री की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी. जब molds बनाने, यह महत्वपूर्ण है के लिए सिलिकॉन चिपकने वाला की राशि का इस्तेमाल कम से कम करने के लिए और सुनिश्चित करें कि यह टयूबिंग की बहुत छोर पर स्थित है. यह है क्योंकि चिपकने वाला निकट myoblasts के लिए नहीं इलाज के कई दिनों के बाद भी व्यवहार्य हो, करते हैं. इसके अलावा, यह ऊतक constructs की तैयारी के रूप में contaminating fibroblasts तेजी से बढ़ और अंततः संस्कृति के myogenic घटकों डूब जाएगा से पहले केवल एक या दो दिन के लिए myoblasts थाली में समझदारी है. इसी तरह, myoblasts घनी नहीं किया जा मढ़वाया चाहिए क्योंकि एक दूसरे के साथ संपर्क में कोशिकाओं को फ्यूज करने के लिए और myotubes में अंतर शुरू हो जाएगा. ऊतक constructs के निर्माण के संबंध में, टाइप 1 कोलेजन के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों के एक नंबर रहे हैं, तथापि, प्रत्येक solidification और अंतिम उत्पाद की निरंतरता की दर में अंतर दर्शाते हैं. इसके अलावा, यह आवश्यक है कि कोलेजन तैयारी यूवी प्रकाश के साथ विकिरणित के रूप में इस प्रक्रिया जमाना प्रक्रिया रोकता है. हमारे हाथों में, एक गहरे गुलाबी से constructs solidification के दौरान एक हल्के गुलाबी रंग बदलने. अंत में, हमारे कोलेजन एसिड solublized तैयारी है (पच पेप्सिन नहीं), इसलिए कदम में 3.5 की जरूरत है मिश्रण का पीएच कोशिकाओं को शामिल करने से पहले 3 NaHCO जोड़कर वृद्धि हुई.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग संस्थागत पशु की देखभाल और बच्चों के अस्पताल के बोस्टन में उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
, गाहनेवाला रिसर्च फंड से एक नई शोधक पुरस्कार, और बच्चों के अस्पताल के बोस्टन में हृदय चालन फंड के लिए योगदान, इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुसंधान अनुदान (HL088206 HL068915) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
