Summary
여기, 우리는 콜라겐 기반 조직 골격 myoblasts를 포함하는 구성의 제조를 보여줍니다. 이러한 3 - D 설계 구조는 조직을 바꾸거나 수리하는 데 사용할 수 있습니다
Abstract
전자 맥박 조정기가있다는 사실에도 불구하고 생명을 구하는 의료 기기, 소아 환자에서 장기적인 성능이 아이의 작은 크기와 자신의 피할 수없는 성장에 의해 부과된 제한 문제 때문에 수 있습니다. 따라서 심장 리듬 장애와 소아 환자를 위해 특별히 설계된 혁신적인 치료법에 대한 진정한 필요가있다. 우리는 그 제안이 들어있는 콜라겐 기반 매트릭스로 구성된 전도성 생물 학적 대체 세포가 더 나은 성장에 적응 반복 수술의 필요성을 절감하며 크게 다음과 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 autologously - 파생. 현재 연구에서 우리는 패션에 히드로겔 매트릭스 내에있는 마음의 상단과 하단 회의소 사이 전선관 될 것입니다 수술 - implantable 조직 구조를 기본 골격 myoblast 세포 문화를 통합을위한 절차를 설명합니다. 궁극적으로, 우리는 완전한 심장 블록과 어린이 방실 전기 전도를 복원할 수 있도록 설계 조직의이 유형을 사용하여 기대하고 있습니다. 그런 관점에서, 우리는 신생아 루이스 쥐 및 플레이트 그 규칙을 수정한 버전을 사용 laminin - 코팅 조직 문화 요리에의 골격 근육에서 myoblasts을 분리
Protocol
1 부 : 주조 금형을 구축 조립
- 실리콘 튜브 (VWR)를 이등분하고 3cm 길이 조각으로 그것을 잘라 면도날을 사용합니다.
- 튜브의 각 끝 안쪽에 이식 등급 RTV 실리콘 접착제 (Rhodia)의 한 방울을 넣으십시오.
- 빨리 실리콘 접착제 드롭에 폴리에스터 메쉬의 작은 조각 (1cm X 1cm) (맥매스터 - 카)를 장소와 튜브의 끝 부분으로 맞춥니다. 이것은 건설 첨부 파일 약간 제기하고 평평한 표면을 제공합니다. 다른 쪽 끝을 위해 반복합니다.
- 금형 3 일 동안 실온에서 건조하도록 허용합니다. 이들은 본질적으로 일회용 있으므로 한 번에 20-30 금형을 만들기 위해 도움이 그것입니다.
- 접착제가 완전히 건조되면 그들이 필요 때까지, 70 % 에탄올로 가득 비커 이러한 금형을 저장합니다. 이 단계는 금형을 소독 도움이 될 것입니다 그리고 완성된 제품은 그림 1에 표시됩니다.
2 부 : myoblast 세포 격리를위한 준비
- 250 1 MG Laminin (시그마)를 희석 ML 0.22 μm의 필터 - 멸균 인산 버퍼 호수 (PBS)가 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen)과 1 %의 Fungizone (Invitrogen)를 포함.
- 4 단계 1.1에서 희석 Laminin 솔루션의 ML과 기본 골격 myoblasts을 도금 전 최소한 4 시간 동안 37 º C에서 부화와 코트 150mm 조직 문화 플레이트 (BD 팔콘).
- (20 % FBS (아틀란타 체액), 5 NG / L 기본 Fibroblast의 성장 인자 (Promega), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen), 그리고 1 %의 Fungizone와 햄의 F - 10 영양소 혼합 (시그마)를 혼합하여 myoblast 미디어 만들기 Invitrogen).
- 100 ML 2.4 U / ML Dispase - 2 (로체)에서 ~ 295 U / MG Collagenase 2 (워싱턴)의 1g을 해소하여 골격 근육 소화 솔루션을 준비합니다. 0.037 g CaCl 2를 추가하고 잘 섞는다. -20 ° C.에 10 ML 주사기 및 매장 aliquots에 장착되어 0.2 μm의 필터 디스크를 사용하여 소화 버퍼를 검사 필터 ° C myoblast 미디어와 함께 37 조직 소화에 필요한 금액을 넣으십시오.
파트 3 : 골격근에서 Myoblast 절연
- 포셉 작은 가위를 사용하여, 척수를 따라 다시 아래로 깔끔히 피부와 근막의 레이어를 다시 필링 후 근육을 절개하여 죽은 신생아 루이스 쥐에서 paraspinal 근육을 제거합니다.
- 조직 문화 후드에서 얼음 1X 행크스 밸런스드 소금 솔루션의 40 ML (HBSS) (Invitrogen)로 가득 50 ML 원뿔 튜브 (BD 팔콘)에 excised 근육을 놓으십시오. 근육 스트립은 튜브의 바닥에 정착 조심스럽게 문화 후드 (베이커)에 살균 파스퇴르 피펫과 진공 흡입하여 액체와 혈액 잔존물의 대부분을 제거할 수 있습니다.
- 150mm 문화 요리에 수확 근육 조각을 붓고 및 흡입과 가능한 한 남은 액체의 많은를 제거합니다. 2 개의 싱글 - 양날 면도날을 사용하면 두꺼운 붙여 조직을 말하다. 붙여넣기 사전 예열 소화 솔루션을 붓고와 10 ML의 피펫을 사용하여 새로운 50 ML 튜브에 혼합을 전송하기만하면됩니다. 효소 소화하는 동안 조직은 때때로 피펫 - 에이드 (드루먼드) 무선에 설치되어 10 ML의 피펫과 (버블링 제외) triturated입니다. 다시 말하지만, 조직이 여분의 액체를 해결하고 제거할 수 있습니다.
- 락을 플랫폼에서 튜브를 삽입하고 약 30 분 37 º C에서 소화.
- 근육이 액화되면 600 XG (베크맨 GP) 10 분 실온에서 70 μm의 셀 스트레이너 (BD 팔콘)와 원심 분리기를 통해 솔루션을 전달합니다. 파스퇴르 피펫과 흡입으로 많은 액체가 가능한 제거하고 따뜻한 myoblast 매체 10 ML와 펠렛을 resuspend.
- 사전 플레이트 15 분 uncoated 150mm 조직 문화 판에있는 세포는 섬유아 세포를 제거하는 데 도움.
- 아직 laminin - 코팅 cultureware에 연결된 모든 1-2 쥐 새끼 한 접시가 너무 희석하지 않은 세포를 전송합니다. 37 ° C와 5 % CO 2에서 humidified 보육 세트에서 접시를 놓습니다.
4 부 : 주조 설계 조직 구조 (5 ML)
- 1-2일 후, 인큐베이터에서 150mm의 myoblast 조직 문화 접시 10을 제거 37 ° C 1X PBS로 두 번 그들을 씻어하고 각 플레이트에 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML를 추가합니다. 5 분 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
- 문화 후드에있는 접시에서 분리 myoblasts을 수확하고 50 ML 튜브에 액체 (BD 팔콘)를 수집합니다. 접시를 모두 씻어 원심 튜브에 세포와 이것을 결합하는 myoblast 매체 10 ML을 사용합니다. 펠렛은 600 XG (베크맨 GP) 10 분 상온에서 세포 단계 3.5에서 설명한대로 초과하는 액체를 제거합니다.
- 얼음 myoblast 매체와 장소의 1.6 ML에 myoblast 세포를 Resuspend.
- 포셉를 사용하면, 신중하게 단계를 1.5에서 4 구조 금형을 제거하고 1X PBS로 두 번 그들을 씻어. 6 잘 조직 세제곱의 각 금형을 삽입하기 전에 파스퇴르 피펫과 함께 PBS의 모든 흔적에서 진공 흡입lture 플레이트 (BD 팔콘).
- 얼음 구축 준비에 필요한 다른 시약을 (10X 햄의 F10, 항생제, 1을 입력 콜라겐 [3.9 MG / ML] [6]과 Matrigel ™) 모아서 37 º C.에 myoblast 미디어를 유지 500 μL 10X 햄의 F10, 100 μL 페니실린 / 스트렙토 마이신, 100 μL Fungizone, 1.6 ML의 콜라겐 및 15 ML 원뿔 관에 750 μL Matrigel ™를. 결합 10 초가 얼음위에 10로 설정 미니 Vortexer (VWR)과 장소를 사용하기위한 솔루션을 섞는다.
- 다음 단계를 3.5에서 혼합 80 NaHCO 3 μL와 단계 3.3 myoblast 서스펜션을 추가합니다. 10 초에 대한 소용돌이 전체 혼합물과 거품의 솔루션을 취소하고 몇 분 얼음 양동이에 튜브를 반환합니다.
- 그것이 10 ML의 피펫을 사용하여 응고하기 시작하기 전에 금형에 혼합물을 조심스럽게을 캐스팅. 각각의 금형은 점성 액체의 약 1 ML를 개최합니다. 이 절차를 수행하는 동안 공기 방울을 도입 피하기 위해보십시오.
- 인큐베이터에 캐스트 구조가 들어있는 접시를 주의깊게 전송합니다. ~ 30 분 후 인큐베이터에서 확정 구성을 제거하고 조심스럽게 조직 구성 충당하기 위해 각 잘하는 myoblast 매체를 추가합니다. 인큐베이터 (그림 2)에 접시를 반환합니다.
제 5 부 : 대표 결과
이 프로토콜이 제대로 실행되면 myoblast 함유 조직 구조는 생체내 주입에 대한 준비가되어 (몰드에서 제거되면 IE) 또는 2 일 후 체외 분석에서 추가하십시오.
완료 금형 구조 그림 1. 예 (단계 1.5 참조).
그림 2. 확정 myoblast 함유 조직 [1]을 구축.
그림 3. myoblast 함유 조직의 H & E 스테인드 섹션 구성. "A"는 세로 부분을 묘사하고 "B"는 단면을 보여줍니다.
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Discussion
조직 구조가 캐스팅 될있는 금형은 어떤 모양과 크기로 만들 수 있지만, 첨부 파일이 최소한 두 지점이있을 필요합니다. 그렇지 않으면, 매트릭스 및 세포는 구형 구조를 형성하고 세포는 죽지. 현재 프로토콜에서, 우리는이 목적을 위해 폴리에스터 메쉬의 사용을 설명, 아직 우리는 성공적으로 스테인리스 메쉬를 사용했습니다. 물론, 큰 금형보다 세포와 다른 재료의 더 큰 볼륨을 요구할 것입니다. 금형을 만들 때 사용하는 실리콘 접착제의 양을 최소화하고이 튜브의 맨 끝에 위치하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 접착제 근처 myoblasts도 치료의 몇 일 후에, 실용적 수없는 경향이 있기 때문입니다. 또한, 그것은 오염 섬유아 세포 빠르게 증식하고 결국 문화의 myogenic 구성 요소를 압도하므로 조직의 구조를 준비하기 전에 단 하루 두 판 myoblasts를 신중하게합니다. 서로 접촉 세포 융합 및 myotubes로 차별하기 시작되므로 마찬가지로, myoblasts는 밀도가 도금해서는 안됩니다. 조직 구조의 제조에 관해서는, 1을 입력합니다 콜라겐의 상용 소스의 숫자가있다, 그러나 각 응고의 속도와 최종 제품의 일관성의 차이를 보여줍니다. 또한,이 프로세스가 겔화 과정을 억제로 콜라겐 준비가 자외선과 반구 없다는 필수적입니다. 우리 손에, 구조는 어두운 분홍색에서 응고하는 동안 밝은 핑크색으로 색상을 변경합니다. 마지막으로, 우리의 콜라겐 준비가 산성 - solublized입니다 (펩신이 소화되지 않음) 단계 3.5 요구 사항에 혼합물의 산도가 세포를 통합하기 전에 NaHCO 3를 추가하여 증가시킬 너무.
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Disclosures
동물 실험은 어린이 병원 보스톤에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
, 쓰래서 연구 기금에서 새 연구원 수상하고, 어린이 병원 보스턴에서 심장 전도 기금에 기부,이 작품은 국립 보건원에서 연구 기금 (HL088206 HL068915)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
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- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
