Summary
هنا ، علينا أن نظهر تصنيع الكولاجين القائم على ثوابت الأنسجة ، والتي تحتوي على myoblasts الهيكل العظمي. ويمكن استخدام هذه التركيبات 3 - D هندستها لاستبدال أو إصلاح الأنسجة
Abstract
على الرغم من حقيقة أن أجهزة تنظيم ضربات القلب الالكترونية هي المنقذة للحياة الأجهزة الطبية ، وعلى المدى الطويل أداء في طب الأطفال المرضى يمكن أن تكون بسبب مشاكل في القيود التي يفرضها حجم الطفل الصغيرة ونموها لا مفر منه. وبالتالي ، هناك حاجة حقيقية لعلاجات مبتكرة تم تصميمها خصيصا للأطفال المرضى الذين يعانون من اضطرابات إيقاع القلب. نقترح أن بديل موصل البيولوجية تتكون من مصفوفة تحتوي على الكولاجين المستندة autologously الخلايا المشتقة يمكن أن تتكيف بصورة أفضل للنمو ، وتقليل الحاجة لجراحات متكررة ، وتحسن كبير في نوعية الحياة لهؤلاء المرضى. في هذه الدراسة ، ونحن تصف الإجراء الأساسي لدمج الخلايا العظمية myoblast الثقافات داخل مصفوفة هيدروجيل لتشكيل بناء الأنسجة جراحيا ، تزرع في الجسم من شأنها أن تكون بمثابة قناة الكهربائية بين الغرف العلوية والسفلية للقلب. في النهاية ، فإننا نتوقع استخدام هذا النوع من الأنسجة المهندسة لاستعادة التوصيل الكهربائية الأذينية البطينية عند الأطفال مع كتلة القلب كاملة. في ضوء ذلك ، ونحن عزل myoblasts من عضلات الهيكل العظمي من الفئران لويس الولدان ولهم على طبق laminin المغلفة أطباق زراعة الأنسجة باستخدام نسخة معدلة من البروتوكولات المعمول بها
Protocol
الجزء 1 : اجمعوا بناء قوالب الصب
- استخدام شفرة حلاقة لخفض أنابيب السيليكون (VWR) ، وتقطعها إربا 3 سم طويلة.
- وضع قطرة من زرع السيليكون اللاصقة الصف RTV (RHODIA) في داخل كل طرف من طرفي الأنبوب.
- المكان بسرعة قطعة صغيرة (1 سم × 1 سم) من شبكة البوليستر (ماكماستر ، كار) في سيليكون لاصقة قطرة ومواءمته مع نهاية الأنبوب. هذا وسوف توفر على سطح مستو ومرتفعة قليلا لبناء مرفق. كرر لنهاية أخرى.
- السماح للالعفن حتى يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أيام. ومن المفيد لجعل 20-30 قوالب في كل مرة ، لأن هذه هي المتاح الأساس.
- مرة واحدة لاصقة جافة تماما ، وتخزين هذه القوالب في كوب مملوء الايثانول 70 ٪ حتى تكون هناك حاجة إليها. وسوف تساعد هذه الخطوة تعقيم قوالب ويظهر المنتج النهائي في الشكل 1.
الجزء 2 : إعداد لعزل الخلايا myoblast
- تمييع 1 ملغ Laminin (سيغما) في 250 مليلتر من 0.22 ميكرون فلتر تعقيم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 ٪ البنسلين / الستبرتوميسين (Invitrogen) وFungizone 1 ٪ (Invitrogen).
- معطف نسيج الثقافة لوحات ملم 150 دينار بحريني (فالكون) مع 4 مل من محلول مخفف من الخطوة Laminin 1.1 و احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات قبل الطلاء وmyoblasts الأولية الهيكل العظمي.
- جعل المتوسطة myoblast عن طريق خلط هام في F - 10 خلطة غذائية (سيغما) مع FBS 20 ٪ (اتلانتا البيولوجية) ، و 5 نانوغرام / لتر نمو الخلايا الليفية الأساسية عامل (Promega) ، 1 ٪ البنسلين / الستبرتوميسين (Invitrogen) ، وFungizone 1 ٪ ( Invitrogen).
- إعداد الهيكل العظمي والعضلات الهضم حل عن طريق إذابة 1 غرام من ~ كولاجيناز يو / 295 ملغ 2 (رثينجتون) في 100 مليلتر من 2.4 U / مل (روش) Dispase - 2. إضافة 0.037 ز CaCl 2 و تخلط جيدا. فلتر تعقيم العازلة الهضم باستخدام قرص 0.2 ميكرون تصفية تركيبها حقنة 10 مل وaliquots المحل في -20 درجة مئوية. مكان المبلغ اللازم لهضم الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع وسائل الإعلام myoblast.
الجزء 3 : العزلة Myoblast من الهيكل العظمي والعضلات
- باستخدام ملقط ومقص صغير ، وإزالة العضلات paraspinal من القتلى لويس الفئران حديثي الولادة عن طريق تشريح أسفل الظهر على طول الحبل الشوكي ، وتقشير الجلد وإعادة طبقات اللفافة ومن ثم استئصال العضلات.
- في نسيج الثقافة هود ، ومكان للعضلات رفعه في أنبوب مخروطي 50 مل دينار بحريني (فالكون) مليئة 40 مل من محلول ملح 1X هانكس المتوازن (HBSS) (Invitrogen) على الجليد. السماح للشرائح العضلات لتستقر في قاع الأنبوب وإزالة بعناية معظم مخلفات السائلة والدم عن طريق شفط فراغ مع ماصة معقمة باستور في غطاء الثقافة (بيكر).
- صب القطع العضلات التي تحصد على طبق الثقافة 150 ملم وإزالة أكبر قدر من السائل المتبقي ممكن مع الشفط. 2 باستخدام شفرات الحلاقة واحدة للفوز اللحم المفروم والأنسجة لعجينة سميكة. من أجل حل قبل تحسنت الهضم على لصق ونقل الخليط إلى أنبوب جديد 50 مل باستخدام ماصة 10 مل. خلال عملية الهضم الأنزيمي ، وأحيانا مسحوق النسيج (بدون فقاعات) مع 10 مل ماصة تركيبها في الماصة لاسلكي - المعونة (دروموند). مرة أخرى ، والسماح لتسوية الأنسجة وإزالة السوائل الزائدة.
- وضع أنبوب على منصة هزاز وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة.
- بمجرد المسال في العضلات ، وتمرير حل من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر دينار بحريني (فالكون) ، وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 600 XG (بيكمان GP). مع ماصة باستير والشفط ، إزالة أكبر قدر من السائل ممكن وresuspend الكرية مع 10 مل من المتوسط myoblast الدافئة.
- قبل لوحة الخلايا غير المصقول على لوحة 150 مم زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة للمساعدة على إزالة الخلايا الليفية.
- نقل الخلايا التي لم تعلق بعد على cultureware laminin المغلفة وتمييع حتى لا يكون هناك لوحة واحدة لكل أنواع الجرذان 1 إلى 2. وضع لوحة في مجموعة حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
الجزء 4 : صب يبني الأنسجة المهندسة (5 مل)
- بعد 1-2 أيام ، وإزالة 10 من 150 مم myoblast زراعة الأنسجة لوحات من الحاضنة ، وشطف لهم مرتين مع 37 درجة مئوية 1X PBS ، وإضافة 4 مل من الحارة 0.05 ٪ التربسين - EDTA لكل لوحة. عودة إلى لوحات الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- حصاد myoblasts بعيدة عن لوحات في غطاء المحرك والثقافة ، وجمع السائل في أنبوب 50 مل دينار بحريني (فالكون). استخدام 10 مل من المتوسط myoblast لشطف كل من لوحات والجمع بين هذا مع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي. بيليه الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 600 XG (بيكمان GP) وإزالة السوائل الزائدة كما هو موضح في الخطوة 3.5.
- Resuspend الخلايا myoblast في 1.6 مل من myoblast المتوسطة ومكان على الجليد.
- باستخدام ملقط ، بعناية إزالة 4 قوالب بناء من الخطوة 1.5 و شطف لهم مرتين مع 1X PBS. شفط فراغ قبالة كل آثار برنامج تلفزيوني مع ماصة باستور قبل ان يضع كل العفن في الأنسجة مكعب 6 - جيداlture وحة دينار بحريني (فالكون).
- جمع الكواشف الأخرى اللازمة لإعداد بناء (F10 هام 10X ، والمضادات الحيوية ، واكتب 1 الكولاجين [3.9 ملغ / مل] [6] وMatrigel ™) على الجليد والحفاظ على وسائل الاعلام myoblast في 37 درجة مئوية. تجمع 500 ميكرولتر 10X هام في F10 ، 100 البنسلين ميكرولتر / الستربتوميسين ، 100 Fungizone ميكرولتر ، 1.6 الكولاجين مل ، و 750 ™ Matrigel ميكرولتر في أنبوب 15 مل المخروطية. مزيج من حل لمدة 10 ثانية باستخدام مصغرة Vortexer (VWR) لتعيين 10 ومكان على الجليد.
- المقبل ، إضافة 80 ميكرولتر من NaHCO (3) وتعليق myoblast من الخطوة 3.3 إلى الخليط من الخطوة 3.5. دوامة الخليط كله لمدة 10 ثانية والعودة إلى أنبوب دلو الثلج لبضع دقائق لمسح حل الفقاعات.
- يلقي بعناية الخليط في قوالب قبل أن تبدأ في ترسيخ باستخدام ماصة 10 مل. وسوف يعقد كل العفن حوالي 1 مل من السائل اللزج. في محاولة لتجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء هذا الإجراء.
- نقل بعناية لوحة تحتوي على ثوابت الزهر إلى الحاضنة. بعد 30 دقيقة ~ ، إزالة يبني طدت من الحاضنة وإضافة بعناية المتوسطة myoblast إلى كل بئر لتغطية الأنسجة بناء. عودة إلى لوحة الحاضنة (الشكل 2).
الجزء 5 : نتائج الممثل
عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، وبناء الأنسجة myoblast المحتوية على استعداد لزرع في الجسم الحي (أي عند إزالتها من القالب) أو لمزيد من التحليلات في المختبر بعد 2 يوما.
الشكل 1. أمثلة من قوالب بناء الانتهاء (انظر الخطوة 1.5).
الشكل 2. وطدت myoblast بناء الأنسجة التي تحتوي على [1].
الشكل 3. H & E المقاطع من النسيج الملون myoblast المحتوية بناء. "A" يصور المقطع الطولي و "باء" يظهر المقطع العرضي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن إجراء القوالب التي سوف يلقي بناء الأنسجة في أي شكل وحجم ، ولكن يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن نقطتين من المرفق. خلاف ذلك ، فإن المصفوفة والخلايا تشكل بنية كروية وتموت الخلايا. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام شبكة البوليستر لهذا الغرض ، ولكن علينا أيضا أن تستخدم بنجاح القابل للصدأ شبكة الصلب. من الواضح ، وسوف تتطلب المزيد من قوالب أكبر الخلايا وحجم أكبر من المكونات الأخرى. عندما صنع قوالب ، فمن المهم لتقليل كمية من مادة لاصقة سيليكون المستخدمة لضمان وأنه يقع في نهايات جدا من الأنبوب. هذا لأن myoblasts بالقرب من لاصقة لا تميل الى أن تكون قابلة للحياة ، حتى بعد عدة ايام من المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه من الحكمة لوحة myoblasts ليوم واحد فقط أو اثنين قبل إعداد بنيات الأنسجة الليفية وتلويث سوف تتكاثر بسرعة وتطغى في النهاية عناصر مولدة للعضل من الثقافة. وبالمثل ، لا ينبغي أن تكون مطلية myoblasts كثيفة لأن الخلايا على اتصال مع بعضها البعض ستبدأ في الصمامات وتفرق في myotubes. في ما يتعلق تلفيق من بنيات الأنسجة ، وهناك عدد من المصادر المتاحة تجاريا من الكولاجين من النوع 1 ، ولكن كل شرح الفروق في معدل التصلب والثبات للمنتج النهائي. علاوة على ذلك ، فمن الضروري أن لا يتم إعداد الكولاجين المشع للأشعة فوق البنفسجية كما يمنع هذه العملية عملية تهليم. في أيدينا ، ويبني تغيير اللون الوردي من الظلام الى النور الوردي أثناء التصلب. أخيرا ، وإعداد لدينا الكولاجين هو حمض solublized (لا البيبسين هضم) ، وذلك لزيادة درجة حموضة الخليط في الخطوة 3.5 احتياجات بإضافة NaHCO 3 قبل دمج الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم في مستشفى بوسطن للأطفال.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل عن طريق المنح البحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 ؛ HL088206) ، وجائزة الباحث جديد من صندوق البحوث Thrasher ، والمساهمات في صندوق التوصيل القلب في مستشفى بوسطن للأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
