Summary
Aqui, demonstramos a fabricação de colágeno baseado em construções de tecido contendo os mioblastos esqueléticos. Essas construções 3-D de engenharia podem ser usados para substituir ou reparar tecidos
Abstract
Apesar do facto de pacemakers eletrônicos são salva-vidas dispositivos médicos, o seu desempenho a longo prazo em pacientes pediátricos pode ser problemático, devido a restrições impostas pelo pequeno tamanho de uma criança e seu crescimento inevitável. Conseqüentemente, há uma necessidade genuína para terapias inovadoras projetadas especificamente para pacientes pediátricos com distúrbios do ritmo cardíaco. Propomos que uma alternativa condutora biológica consiste de uma matriz à base de colágeno contendo autologously células derivadas poderiam se adaptar melhor ao crescimento, reduzir a necessidade de cirurgias recorrentes, e melhorar significativamente a qualidade de vida para esses pacientes. No presente estudo, descrevemos um procedimento para a incorporação de culturas de células primárias de mioblastos esqueléticos dentro de uma matriz de hidrogel para moldar uma estrutura de tecido cirurgicamente implantável, que servirá como um conduíte elétrico entre as câmaras superior e inferior do coração. Em última instância, nós antecipamos usando este tipo de engenharia de tecidos para restaurar a condução elétrica atrioventricular em crianças com bloqueio cardíaco completo. Em vista disso, isolamos mioblastos de músculo esquelético de ratos Lewis neonatal e placa-los para laminina revestido pratos de cultura de tecidos usando uma versão modificada de protocolos estabelecidos
Protocol
Parte 1: Montar construir moldes de fundição
- Use uma lâmina de barbear para cortar pela metade tubos de silicone (VWR) e corte-o em três pedaços cm de comprimento.
- Coloque uma gota de implante de silicone RTV-grade adesiva (Rhodia) no interior de cada extremidade do tubo.
- Colocar rapidamente um pequeno pedaço (1 cm x 1 cm) de poliéster malha (McMaster-Carr) na queda adesivo de silicone e alinhá-lo com a extremidade do tubo. Isso irá proporcionar uma superfície ligeiramente elevada e plana para fixação construir. Repita o procedimento para a outra extremidade.
- Permitir que o molde para secar em temperatura ambiente por 3 dias. É útil para fazer 20-30 moldes ao mesmo tempo, uma vez que estas são essencialmente descartáveis.
- Uma vez que o adesivo é completamente seco, armazene esses moldes num copo cheio de etanol 70% até que sejam necessários. Este passo ajudará a esterilizar os moldes eo produto final é mostrado na Figura 1.
Parte 2: Preparação para o isolamento de células mioblastos
- Diluir 1 mg laminina (Sigma) em 250 mL 0,22 M esterilizada por filtração, tampão fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) e Fungizone 1% (Invitrogen).
- Casaco 150 milímetros placas de cultura de tecidos (BD Falcon) com 4 mL da solução diluída de laminina passo 1.1 e incubar a 37 º C por pelo menos 4 horas antes do plaqueamento os mioblastos esqueléticos primários.
- Tornar o meio de mioblastos, misturando F-10 Ham Mistura de nutrientes (Sigma) com FBS 20% (Atlanta Biologicals), 5 ng / L Fator de crescimento básico de fibroblastos (Promega), 1% Penicilina / Estreptomicina (Invitrogen), e Fungizone 1% ( Invitrogen).
- Preparar a solução de digestão do músculo esquelético, dissolvendo 1 g de ~ 295 U / mg de colagenase 2 (Worthington) em 100 mL 2,4 U / mL Dispase-2 (Roche). Adicionar 0,037 g CaCl 2 e misture bem. Filtro de esterilizar o tampão de digestão usando um disco de 0,2 mM de filtro montado em uma seringa de 10 mL e alíquotas armazenar a -20 ° C. Coloque a quantidade necessária para a digestão do tecido a 37 ° C, juntamente com a mídia mioblastos.
Parte 3: isolamento mioblastos de músculo esquelético
- Utilizando uma pinça e uma tesoura pequena, retire músculos paravertebrais de ratos mortos neonatal Lewis por corte nas costas ao longo da medula espinhal, retirar as camadas da pele e fáscia e, em seguida, extirpando os músculos.
- Em uma capa de cultura de tecidos, coloque os músculos excisadas em um tubo de 50 ml (BD Falcon) preenchida com 40 mL de solução de sal 1X Hanks Balanced (HBSS) (Invitrogen) no gelo. Permita que as tiras do músculo em repouso para a parte inferior do tubo e retire cuidadosamente a maior parte dos restos de líquido e sangue por sucção a vácuo com uma pipeta Pasteur estéril em uma capa de cultura (Baker).
- Despeje as peças muscular colhidas em uma placa de cultura 150 mm e remover o máximo do líquido restante possível com sucção. Usando duas lâminas de barbear única gumes mince o tecido para uma pasta grossa. Despeje pré-aquecido solução digestão sobre a pasta e transferir a mistura para um tubo mL fresco 50 usando uma pipeta 10 mL. Durante a digestão enzimática, o tecido é ocasionalmente triturado (sem bolhas) com uma pipeta de 10 mL provido em um fio Pipetar-Aid (Drummond). Mais uma vez, permitir que o tecido para resolver e remover o excesso de líquido.
- Colocar o tubo em uma plataforma de balanço e digerir a 37 º C por cerca de 30 min.
- Uma vez que o músculo é liquefeito, passar a solução através de um filtro de células 70 mM (BD Falcon) e centrifugar a temperatura ambiente por 10 min a 600 xg (Beckman GP). Com uma pipeta Pasteur e sucção, remover o máximo de líquido possível e ressuspender o sedimento com 10 ml de meio de mioblastos quente.
- Pré-plate as células em um prato de 150 milímetros de cultura de tecidos revestidos por 15 minutos para ajudar a remover fibroblastos.
- Transferência das células que ainda não anexado ao cultureware laminina-revestido e diluir para que haja uma placa para cada 1 a 2 filhotes de ratos. Coloque a placa em um conjunto incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO 2.
Parte 4: Fundição construções da engenharia de tecidos (5 mL)
- Após 1 a 2 dias, retire 10 da 150 milímetros mioblastos placas de cultura de tecidos da incubadora, lave-os duas vezes com 37 ° C 1X PBS, e adicionar 4 mL de morno 0,05% Tripsina-EDTA para cada prato. Retornar as placas para a incubadora por 5 min.
- Colher os mioblastos destacada das placas no bairro cultura e recolher o líquido em um tubo de 50 mL (BD Falcon). Use 10 mL de meio de mioblastos para lavar todos os pratos e combinar isso com as células no tubo de ensaio. Agregar as células em temperatura ambiente por 10 min a 600 xg (Beckman GP) e remova o excesso de líquido, tal como descrito no passo 3.5.
- Ressuspender as células mioblastos em 1,6 mL de meio de mioblastos e colocar no gelo.
- Usando pinça, retire cuidadosamente quatro moldes construir a partir do passo 1.5 e lave-os duas vezes com PBS 1X. Sucção a vácuo off todos os vestígios de PBS com uma pipeta Pasteur, antes de colocar cada molde em um cu bem 6-tecidoLTURE placa (BD Falcon).
- Reúna os outros reagentes necessários para a preparação de construir (F10 Ham 10X é, antibióticos, colágeno tipo 1 [3,9 mg / mL] [6] e Matrigel ™) sobre o gelo e manter meios de comunicação mioblastos a 37 º C. Combine 500 mL 10X Ham F10, 100 mL penicilina / estreptomicina, 100 Fungizone mL, 1,6 mL de colágeno, e 750 ™ Matrigel mL em tubo cônico de 15 mL. Misturar a solução por 10 segundos usando um Mini-Vortexer (VWR) definida para 10 e colocar no gelo.
- Em seguida, adicione 80 mL de NaHCO 3 ea suspensão mioblastos a partir do passo 3.3 para a mistura a partir do passo 3.5. Vortex toda a mistura por 10 segundos e retornar o tubo para o balde de gelo para um poucos minutos para limpar a solução de bolhas.
- Cuidadosamente elenco a mistura nos moldes antes que comece a solidificar usando uma pipeta 10 mL. Cada molde irá realizar cerca de 1 mL do líquido viscoso. Tente evitar a introdução de bolhas de ar durante este procedimento.
- Transferir cuidadosamente a placa contendo as construções elenco para a incubadora. Depois de ~ 30 min, retire as construções solidificadas da incubadora e adicione cuidadosamente médio mioblastos a cada poço para cobrir o tecido construir. Devolver a placa para a incubadora (Figura 2).
Parte 5: Os resultados representativos
Quando este protocolo é executado corretamente, o construto de tecido contendo mioblastos está pronto para implantação em vivo (ou seja, quando removido do molde) ou para mais nas análises in vitro após 2 dias.
Figura 1. Exemplos de concluídos moldes construir (veja o Passo 1.5).
Figura 2. A solidificou mioblastos contendo tecido construir [1].
Figura 3. H & E cortes corados de um tecido mioblastos contendo construir. "A" mostra uma seção longitudinal e "B" mostra um corte transversal.
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Discussion
Os moldes em que a construção de tecido serão lançados podem ser feitas em qualquer formato e tamanho, no entanto, é preciso haver pelo menos dois pontos de fixação. Caso contrário, a matriz e as células formam uma estrutura esférica e as células morrem. No protocolo, descrevemos o uso de uma malha de poliéster para esta finalidade, mas também temos utilizado com sucesso malha de aço inoxidável. Obviamente, moldes maiores exigirá mais células e um maior volume de outros ingredientes. Ao fazer os moldes, é importante para minimizar a quantidade de silicone adesivas utilizadas e garantir que ele está localizado nas extremidades do tubo muito. Isto é porque mioblastos perto do adesivo tendem a não ser viável, mesmo após vários dias de cura. Além disso, é prudente a placa de mioblastos para apenas um dia ou dois antes de preparar o tecido constrói como fibroblastos contaminando irá multiplicar-se rapidamente e, eventualmente, superar os componentes miogênica da cultura. Da mesma forma, os mioblastos não deve ser banhado densamente porque as células em contato uns com os outros começarão a se fundir e se diferenciar em miotubos. No que diz respeito à fabricação das construções de tecido, há um número de fontes disponíveis no mercado de colágeno tipo 1, no entanto, cada demonstrar diferenças na taxa de solidificação e da consistência do produto final. Além disso, é essencial que a preparação de colágeno não é irradiado com luz UV como este processo inibe o processo de gelificação. Em nossas mãos, as construções de uma mudança de cor rosa escuro para um rosa claro durante a solidificação. Finalmente, nossa preparação colágeno é o ácido-solublized (não digerida pepsina), de modo que o pH da mistura em passo 3.5 precisa ser aumentado pela adição de NaHCO 3 antes de incorporar as células.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital Infantil de Boston.
Acknowledgments
Este trabalho é suportado por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915; HL088206), o Prêmio Pesquisador Nova do Fundo de Investigação Thrasher, e contribuições para o Fundo de Condução Cardíaca do Hospital Infantil de Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
