Summary
Ici, nous démontrons la fabrication de base de collagène, le tissu des constructions contenant myoblastes squelettiques. Ces constructions en 3-D modifiés peuvent être utilisés pour remplacer ou réparer des tissus
Abstract
Malgré le fait que les stimulateurs électroniques sont des dispositifs de sauvetage médical, leur performance à long terme chez les patients pédiatriques peut être problématique du fait des restrictions imposées par la petite taille de l'enfant et leur croissance inévitable. Par conséquent, il ya un véritable besoin pour des thérapies innovantes conçues spécifiquement pour les patients pédiatriques atteints de troubles du rythme cardiaque. Nous proposons qu'une alternative conducteur biologiques constitués d'une matrice à base de collagène autologue contenant des cellules dérivées pourrait mieux s'adapter à la croissance, réduire le besoin de chirurgies récurrentes, et d'améliorer grandement la qualité de vie de ces patients. Dans la présente étude, nous décrivons une procédure pour intégrer primaires du squelette des cultures de cellules myoblastes dans une matrice d'hydrogel à la mode d'une construction des tissus implantables chirurgicalement qui servira comme un conduit électrique entre les chambres supérieures et inférieures du cœur. Finalement, nous prévoyons d'utiliser ce type d'ingénierie tissulaire pour restaurer la conduction électrique auriculo-ventriculaire chez les enfants présentant un bloc auriculo-ventriculaire complet. Compte tenu de cela, nous isolons les myoblastes dans les muscles squelettiques de rats Lewis néonatale et la plaque-les sur la laminine revêtement des boîtes de culture tissulaire en utilisant une version modifiée de protocoles établis
Protocol
Partie 1: Réunir construire des moules de fonderie
- Utilisez une lame de rasoir pour réduire de moitié tube en silicone (VWR) et le couper en 3 morceaux cm de long.
- Déposer une goutte d'implant de qualité adhésive silicone RTV (Rhodia) à l'intérieur de chaque extrémité du tube.
- Vite placer un petit morceau (1 cm x 1 cm) de filet de polyester (McMaster-Carr) sur la chute d'adhésif de silicone et de l'aligner avec le bout du tuyau. Cela fournira une surface légèrement surélevé et plate pour la fixation de construire. Répétez l'opération pour l'autre extrémité.
- Laisser le moule à sécher à température ambiante pendant 3 jours. Il est utile de faire 20 à 30 moules à la fois, que ce sont essentiellement à usage unique.
- Une fois la colle est complètement sèche, de stocker ces moules dans un bécher rempli avec de l'éthanol à 70% jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires. Cette étape permettra de stériliser les moules et le produit fini est montré dans la figure 1.
Partie 2: Préparation pour l'isolation des myoblastes
- Diluer 1 mg laminine (Sigma) dans 250 ml de 0,22 um, stérilisée par filtration tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine (Invitrogen) et Fungizone 1% (Invitrogen).
- Manteau plaques de 150 mm de culture de tissu (BD Falcon) avec 4 ml de la solution diluée laminine partir de l'étape 1.1 et incuber à 37 º C pendant au moins 4 heures avant l'étalement des myoblastes squelettiques primaires.
- Faire le support myoblastes en mélangeant Ham F-10 mélange nutritif (Sigma) avec du FBS à 20% (Atlanta Biologicals), 5 ng / L facteur de croissance basique des fibroblastes (Promega), 1% de pénicilline / streptomycine (Invitrogen), et Fungizone 1% ( Invitrogen).
- Préparer la solution du muscle squelettique de digestion en dissolvant 1 g de ~ 295 U / mg collagénase 2 (Worthington) dans 100 ml 2,4 U / ml Dispase-2 (Roche). Ajouter 0,037 g de CaCl 2 et bien mélanger. Filtre stériliser le tampon de digestion en utilisant un disque filtre de 0,2 um monté sur une seringue de 10 ml et des aliquots conserver à -20 ° C. Placez la quantité nécessaire pour la digestion des tissus à 37 ° C avec les médias des myoblastes.
Partie 3: isolement des myoblastes du muscle squelettique
- En utilisant des pinces et des petits ciseaux, retirez muscles spinaux de rats Lewis morts néonatales par tranchage en bas du dos le long de la moelle épinière, éplucher la peau et les couches du fascia puis exciser les muscles.
- Dans une hotte de culture de tissus, placer les muscles excisés dans un tube conique de 50 ml (BD Falcon) rempli avec 40 ml de 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) sur la glace. Laisser les bandelettes de muscle pour se déposent au fond du tube et retirez soigneusement la plupart des restes de liquide et de sang par aspiration sous vide avec une pipette stérile Pasteur dans une hotte de la culture (Baker).
- Verser les morceaux de muscle récoltés sur une boîte de culture de 150 mm et enlever le plus de liquide restant possible avec aspiration. En utilisant deux lames de rasoir seul tranchant émincer les tissus d'une pâte épaisse. Verser la solution de digestion préchauffé sur la pâte et transférer le mélange dans un nouveau tube de 50 ml à l'aide d'une pipette de 10 ml. Pendant la digestion enzymatique, le tissu est parfois triturés (sans bulles) avec une pipette 10 ml monté sur un fil pipette-Aid (Drummond). Encore une fois, laisser le tissu de régler et retirer l'excès de liquide.
- Placer le tube sur une plateforme à bascule et digérer à 37 º C pendant environ 30 min.
- Une fois que le muscle est liquéfié, passer la solution à travers une passoire cellule 70 um (BD Falcon) et centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 600 xg (Beckman GP). Avec une pipette Pasteur et d'aspiration, enlever autant de liquide que possible et remettre le culot avec 10 mL de milieu de myoblastes chaud.
- Pré-plaque de cellules sur une plaque de culture non couché 150 mm de tissu pendant 15 minutes pour aider à éliminer les fibroblastes.
- Transférer les cellules qui n'ont pas encore attaché à la laminine cultureware enduits et diluer afin qu'il y est une plaque pour tous les 1 à 2 chiots rat. Placer la plaque dans un ensemble incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2.
Partie 4: Moulage des constructions de l'ingénierie tissulaire (5 ml)
- Après 1 à 2 jours, retirer 10 des 150 plaques myoblastes de culture tissulaire mm de l'incubateur, les rincer deux fois avec 37 ° C PBS 1X, et ajouter 4 ml d'eau tiède 0,05% de trypsine-EDTA à chaque plaque. Retour des plaques dans l'incubateur pendant 5 min.
- Récolter les myoblastes détachées des plaques dans la hotte de la culture et de recueillir le liquide dans un tube de 50 ml (BD Falcon). Utiliser 10 mL de milieu de myoblastes pour le rinçage de toutes les plaques et de combiner cela avec les cellules dans le tube à centrifuger. Pellet les cellules à température ambiante pendant 10 min à 600 xg (Beckman GP) et enlever l'excès de liquide tel que décrit dans l'étape 3.5.
- Resuspendre les cellules myoblastes dans 1,6 mL de milieu de myoblastes et les placer sur la glace.
- En utilisant une pince, retirez soigneusement 4 moules de construire de l'étape 1.5 et les rincer deux fois avec du PBS 1X. Aspiration hors toute trace de PBS avec une pipette Pasteur avant de placer chaque moule dans une cu tissus à 6 puitsPlaque LTURE (BD Falcon).
- Rassemblez les autres réactifs nécessaires pour la préparation de la construction (F10 de Ham 10X, les antibiotiques, collagène de type 1 [3,9 mg / ml] [6] et de Matrigel ™) sur la glace et de garder les médias myoblastes à 37 º C. Combinez 500 ul 10X Ham F10, 100 uL de pénicilline / streptomycine, 100 Fungizone ul, 1,6 ml de collagène, et 750 ™ Matrigel uL dans un tube 15 ml conique. Mélanger la solution pendant 10 secondes en utilisant un mini-Vortexer (VWR) fixé à 10 et les placer sur la glace.
- Ensuite, ajouter 80 ul de NaHCO 3 et la suspension de l'étape myoblastes 3,3 à mélange de l'étape 3.5. Vortex l'ensemble du mélange pendant 10 secondes et retourner le tube pour le seau à glace pendant quelques minutes pour effacer la solution de bulles.
- Soigneusement coulée le mélange dans les moules avant qu'il commence à se solidifier à l'aide d'une pipette de 10 ml. Chaque moule peut contenir environ 1 mL du liquide visqueux. Essayez d'éviter d'introduire des bulles d'air lors de cette procédure.
- Soigneusement transfert de la plaque contenant les constructions exprimées à l'incubateur. Après ~ 30 min, retirez les constructions solidifié de l'incubateur et ajouter prudemment moyennes myoblastes dans chaque puits afin de couvrir le tissu construire. Retour à la plaque de l'incubateur (figure 2).
Partie 5: Les résultats représentatifs
Lorsque ce protocole est correctement exécutée, la construction des tissus contenant des myoblastes est prêt pour implantation in vivo (c'est à dire lorsqu'il est retiré du moule) ou pour d'autres analyses in vitro après 2 jours.
Exemples Figure 1. Des moules achevée de construire (voir l'étape 1.5).
Figure 2. Un solidifié myoblastes tissu contenant de construire [1].
Figure 3. Sections H & E teinté d'un tissu contenant des myoblastes construire. «A» représente une coupe longitudinale et "B" montre une section transversale.
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Discussion
Les moules dans lesquels la construction des tissus seront jetés peuvent être faites dans n'importe quelle forme et taille, mais il doit y avoir au moins deux points de fixation. Sinon, la matrice et les cellules forment une structure sphérique et les cellules meurent. Dans le présent protocole, nous décrivons l'utilisation d'un maillage de polyester à cet effet, mais nous avons aussi utilisé avec succès maille d'acier inoxydable. Évidemment, les grands moules, il faudra plus de cellules et un plus grand volume des autres ingrédients. Lorsque vous faites des moules, il est important de minimiser la quantité de colle silicone utilisés et de s'assurer qu'il est situé à l'extrémité même de la tubulure. C'est parce que les myoblastes près la colle ont tendance à ne pas être viable, même après plusieurs jours de durcissement. En outre, il est prudent de plaque de myoblastes pour seulement un ou deux jours avant de préparer les constructions que les fibroblastes du tissu contaminant se multiplient rapidement et finalement submerger les composants myogénique de la culture. De même, les myoblastes ne doit pas être plaquée densément parce que les cellules en contact avec l'autre va commencer à fusionner et de se différencier en myotubes. En ce qui concerne la fabrication des constructions des tissus, il ya un certain nombre de sources disponibles dans le commerce du collagène de type 1, mais chacun de démontrer les différences dans le taux de solidification et la consistance du produit final. Par ailleurs, il est essentiel que la préparation de collagène n'est pas irradié par la lumière UV que ce processus inhibe le processus de gélification. Dans nos mains, les constructions changent de couleur d'un rose foncé au rose pâle lors de la solidification. Enfin, notre préparation de collagène est l'acide-solubilisé (non digérées par la pepsine), de sorte que le pH du mélange à l'étape 3.5 doit être augmentée en ajoutant NaHCO 3 avant d'incorporer les cellules.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l'Hôpital pour enfants de Boston.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions de recherche du National Institutes of Health (HL068915; HL088206), un Prix du nouveau chercheur du Fonds de recherche Thrasher, et les contributions au Fonds de la conduction cardiaque au Centre hospitalier pour enfants de Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
