Summary
Eine einfache, kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse vorgestellt. Unser Protokoll sieht vor Feuchtigkeit und Gasaustausch und komprimiert nicht die Drosophila-Embryo. Diese Methode eignet sich für GFP-basierte Live-Darstellung von Drosophila-Embryonen mit einem Stereomikroskop oder aufrecht zusammengesetzte Mikroskop.
Abstract
Das grün fluoreszierende Protein (GFP)-basierte Zeitraffer Live-imaging ist eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung der genetischen Regulation von dynamischen Prozessen wie Gewebemorphogenese, Zell-Zell-Adhäsion oder Zelltod. Drosophila-Embryos, die GFP sind leicht abgebildet entweder mit stereoskopischen oder konfokalen Mikroskopie. Ein Ziel eines jeden Live-imaging-Protokoll ist es, schädliche Auswirkungen wie Dehydratation und Hypoxie zu minimieren. Vorherige Protokolle für die Vorbereitung Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse beteiligt Platzierung dechorionated Embryonen in Halocarbonöl und sandwiching sie zwischen einem Halogenkohlenwasserstoff gasdurchlässige Membran und einem Deckglas
Protocol
Vorbereitung
- Sammeln Embryonen auf Standard Traubensaft Agar Platten 4. Es ist zweckmäßig, eine automatisierte Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment Ltd) zu verwenden. Verwenden von synchronen inszeniert Embryo Sammlungen wird die Zahl der dechorionations, die durchgeführt werden, um eine ausreichende Anzahl von Embryonen in der gewünschten Entwicklungsstadium zu erhalten muss zu reduzieren.
- Bereiten Sie eine dechorionation gleiten durch die Anbringung eines Stück doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger, ziehen Sie die Schutzfolie vom Band.
- Bereiten Sie die Live-Imaging-Kammer, indem ein Stück des Gewebes in der auch der Kammer passen. Legen Sie das Gewebe in den Brunnen und nass ist es mit destilliertem Wasser.
- Mix Halocarbonöl (Halocarbon Products Corp) Viskosität Serie 700 und Serie 56 mit einem Verhältnis von 1:1. Die Mischung kann gespeichert und verwendet werden auf unbestimmte Zeit.
- Legen Sie mehrere kleine Tropfen Halocarbonöl auf der Oberfläche von einem Deckglas (22 X 40 mm, Nr. 2). Die Lautstärke ist nicht kritisch, sollte aber in der Reihenfolge von 20-40 ul werden.
Verfahren
- Mit Hilfe von einem Stereomikroskop, sammeln Embryonen aus der Traubensaft-Agar-Platten entweder mit einem Paar von Juwelier Zange (Nr. 5) oder eine sehr feine Pinsel. Embryonen neigen dazu, miteinander und mit der Zange "Spitzen-Stick, sie sind leicht in Klumpen zusammen.
- Mit Hilfe von einem Stereomikroskop, sanft niedriger die Klumpen von Embryonen, die zu den Spitzen der Pinzette auf die Oberfläche des Bandes auf der dechorionation schieben müssen eingehalten werden.
- Wieder mit dem Stereomikroskop, sanft anstoßen oder Schlaganfall die Embryonen mit der Seite der Zange um Aufbrechen der äußeren wachsartige Chorion ohne Zerreißen der inneren Dotterhaut (der Embryo wird platzen, wenn die Dotterhaut ist gebrochen).
- Sobald die äußere Chorion wurde gebrochen hat, necken sich der Embryo aus dem Chorion, der dechorionated Embryo neigt dazu, an die Oberfläche der Zange zu halten. Achten Sie darauf, berühren Sie nicht die dechorionated Embryo auf der Oberfläche des Bandes.
- Sobald ein Embryo dechorionated ist, schnell zu übertragen, um die zuvor hergestellte Tropfen Halocarbonöl auf dem Deckglas. Berühren Sie die Spitze der Zange Durchführung der dechorionated Embryo in die Oberfläche des Halocarbonöl drop - das löst den Embryo aus der Zange in das Öl.
- Bestätigen Übertragung des Embryos auf die Öltropfen. Dies kann mit dem bloßen Auge, sofern Sie über einen schwarzen Hintergrund arbeiten und eine faseroptische Lichtquelle in einem schrägen Winkel gesetzt getan werden.
- Bevor Sie versuchen, ein anderer Embryo dechorionate, sauber kein Öl aus der Zange. Pinzetten in Öl überzogen haben weniger Kauf auf dem Chorion Oberfläche, so dass dechorionation erschwert.
- Dechorionated Embryonen sind lebhaft in der Halocarbonöl. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel und während Sie durch ein Stereomikroskop, drücken Sie den Embryo an der Unterseite der Öltropfen und ordnen sie in die gewünschte Position.
- Schnell umdrehen das Deckglas über dem Brunnen der Live-Imaging-Kammer. Bestätigen Sie, dass die Embryonen vor dem Deckglas ruht in der gewünschten Orientierung. Durch den Auftrieb im Öl, wird die Embryonen nun gegen die untere Fläche des Deckglases zu schweben. Befestigen Sie das Deckglas auf die Live-Imaging-Kammer mit Klebeband. Lüften Sie den Raum, indem Löcher in das Band in der Gegend, wo das Band erstreckt sich über die Lücke zwischen dem Ende des Deckglases und das Ende der gut von der Live-Imaging-Kammer.
- Eine aufrechte Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz-Stereomikroskop kann nun verwendet werden, um Bild die Embryonen werden.
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Discussion
Wir beschreiben eine neue Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-Imaging-Analyse, die wir als die hängenden Tropfen Protokoll. Leider ist es nicht möglich, den hängenden Tropfen-Protokoll verwenden, wenn die Arbeit mit einem inversen Mikroskop. In diesem Fall wird die Sandwich-Technik (wie in der abstrakten oben beschrieben) verwendet werden muss und Kompression der Embryonen weiterhin Anlass zur Sorge.
In Experimenten, bei denen Zellen Form und Größe gemessen, um gemeinsam mit morphogenetischen Bewegung in Verbindung gebracht zu berechnen sind, ist die Verwendung von einem aufrechten Mikroskop und die hängenden Tropfen Protokoll vorzuziehen wegen verminderter Embryo Komprimierung. Außerdem wurde reduziert Embryo Komprimierung mit dem hängenden Tropfen Protokoll die Folge präsentiert die Runde, unverzerrte Oberfläche des Embryos während der sandwiching Technik stellt eine Abflachung. Bei Verwendung der konfokalen Mikroskopie ist es daher notwendig, zu sammeln eine breitere Z-Stapel (mehr Scheiben pro Stapel), wenn Sie die hängenden Tropfen-Protokoll gegenüber dem Sandwich-Methode. Die erhöhte Anzahl von Scheiben pro Z-Stapel, erhöht jedoch Aufnahmezeit sowie ein Foto-Toxizität oder Foto-Bleichen mit Laser-Anregung verbunden. Natürlich ist die experimentelle profitieren mit reduzierter Kompression verbundenen teilweise durch eine Erhöhung in Z-Stapel-Messzeiten ausgeglichen. Trotz dieses Anstiegs in Z-Stapel-Übernahme Zeit jedoch haben wir ausgezeichnete Lebensfähigkeit von Embryonen mit dem hängenden Tropfen Protokoll beobachtet.
Die hängenden Tropfen Protokoll wird auch auf die Beobachtung von Embryonen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, in dem der Lichtweg des einfallenden und emittierten Lichts nicht durch die Live-imaging Kammer nicht passieren begrenzt. Live-Imaging-Embryonen mit DIC-Mikroskopie oder andere nicht-Fluoreszenzoptik könnten, indem Sie die Live-imaging Kammer auf einen Lichtweg von der Kondensator durch den suspendierten Embryos erlauben erreicht werden.
Ein Problem bei der Nutzung der hängende Tropfen Technik kann unerwünschte Bewegungen oder "Driften" von Embryonen in das Blickfeld während Zeitraffer Akquisition werden. Als schwimmende gegen die Unterseite der umgedrehten Deckglas, so finden wir, dass die Embryonen bemerkenswert stabil sind und nicht in Position zu verschieben, wenn Sie entweder trocken oder Ölimmersionsobjektive. Multipoint Zeitraffer Akquisition mit einem motorisierten Mikroskop Bühne auch nicht stören die Positionen von Embryonen, die unter Verwendung der hängende Tropfen Protokoll. Jede Bewegung von Embryonen hergestellt unter Verwendung der hängenden Tropfen Technik kann durch die Reduzierung der Größe der Halocarbonöl fallen zu lassen und sicherzustellen, dass getrennte Öl-Tropfen sind nicht fixiert oder Wicking am Rande des Live-imaging Kammer auch beseitigt werden.
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Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Unterstützung zu BHR durch ein Discovery-Stipendium sowie ein Recherche-Tools und Instrumenten-Stipendium der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir erkennen auch H. Oda und die Bloomington Drosophila Lager-Center für die Bereitstellung von genetischen Aktien, die im Beispiel Live-Imaging-Sequenzen verwendet wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
