Summary
En enkel, billig och effektiv metod för att förbereda Drosophila embryon för live-bildanalys presenteras. Vår protokollet ger fukt och gas utbyte och inte komprimera Drosophila embryot. Denna metod är lämplig för GFP-baserade Live avbildning av Drosophila embryon med hjälp av ett stereomikroskop eller upprätt sammansatt mikroskop.
Abstract
Grönt fluorescerande protein (GFP)-baserade timelapse live-avbildning är en kraftfull teknik för att studera den genetiska regleringen av dynamiska processer såsom vävnad morfogenes, cell-cell adhesion, eller celldöd. Drosophila embryon uttrycka GFP är lätt avbildas med antingen stereoskopiska eller konfokalmikroskopi. Ett mål för varje levande-imaging-protokollet är att minimera negativa effekter som uttorkning och hypoxi. Föregående protokollen för att förbereda Drosophila embryon för live-bildanalys har inneburit att placera dechorionated embryon i Halocarbon olja och sandwiching dem mellan ett Halocarbon gas-membran och ett täckglas
Protocol
Förberedelser
- Samla embryon på vanliga druvsaft agarplattor 4. Det är bekvämt att använda ett automatiserat Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd). Använda synkrona iscensatt embryo samlingar kommer att minska antalet dechorionations som måste utföras för att få tillräckligt många embryon på önskad utvecklingsstadiet.
- Förbered en dechorionation bild genom att fästa en bit dubbelhäftande tejp på ett objektglas, ta bort skyddspapperet från tejpen.
- Förbered Bildproduktion kammaren genom att skära en bit vävnad för att passa i brunnen i kammaren. Placera vävnad i brunnen och blöt det med destillerat vatten.
- Blanda Halocarbon olja (Halocarbon Products Corp) viskositet serie 700 och serie 56 i förhållandet 1:1. Blandningen kan lagras och användas på obestämd tid.
- Placera flera små droppar Halocarbon olja på ytan av ett täckglas (22 x 40 mm, nr 2). Volymen är inte kritisk men bör vara i storleksordningen 20-40 l.
Förfarande
- Med hjälp av ett stereomikroskop, samla in embryon från druvsaft-agarplattor med hjälp av antingen ett par juvelerares peang (nr 5) eller en mycket fin pensel. Embryon tenderar att hålla sig till varandra och till den pincett "tips, de är lätt samlas i klumpar.
- Med hjälp av ett stereomikroskop försiktigt sänka klumpar av embryon som har anslutit sig till tips av pincetten på ytan av bandet på dechorionation bilden.
- Igen med hjälp av stereomikroskop, försiktigt knuffa eller stroke embryona med sidan av tång för att bryta den yttre vaxartad chorion utan spricker det inre vitelline membranet (embryot kommer att brista om vitelline membranet spruckit).
- När det yttre chorion har brustit, retas embryot från chorion, det dechorionated embryot tenderar att ansluta sig till ytan av peang. Undvik att röra vid dechorionated embryot till ytan av bandet.
- Så snart ett embryo dechorionated, snabbt överföra den till den tidigare beredda droppe Halocarbon olja på täckglas. Tryck på toppen av pincetten bära dechorionated embryot till ytan av Halocarbon olja drop - detta lösgör embryot från pincetten i oljan.
- Bekräfta överföring av embryot till olje droppe. Detta kan göras med blotta ögat, förutsatt att du arbetar mot en svart bakgrund och använda en fiberoptisk belysning källa som i en sned vinkel.
- Innan du försöker dechorionate annat embryo, rengöra någon olja från pincett. Tång belagda i olja har mindre inköp på chorion ytan, vilket gör dechorionation svårare.
- Dechorionated embryon flytkraft i Halocarbon olja. Använd pincett eller en pensel och medan du tittar genom ett stereomikroskop, tryck embryot till botten av oljan sjunka och ordna det på önskad plats.
- Snabbt invertera täckglas över väl av levande avbildning kammaren. Bekräfta att embryona vila mot täckglas i önskad riktning. På grund av sin bärighet i oljan, kommer embryona flyter nu mot den nedre ytan av täckglas. Fäst täckglas till Bildproduktion kammare med tejp. Vädra kammaren genom att skära hål i tejpen i det område där bandet spänner över gapet mellan slutet av täckglas och slutet av brunnen i Bildproduktion kammaren.
- En upprätt fluorescensmikroskop eller fluorescens stereomikroskop kan nu användas för att bilden embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en ny metod för att förbereda Drosophila embryon för live bildanalys, som vi kallar droppe protokollet. Tyvärr är det inte möjligt att använda den hängande droppe-protokollet om att arbeta med ett inverterat mikroskop. I detta fall sandwiching teknik (som beskrivs i abstrakta ovan) måste användas och komprimering av embryona fortfarande ett problem.
I försök där cell form och storlek mäts för att beräkna krafter som är förknippade med morfogenetiska rörelse, är användningen av en upprätt mikroskop och droppe protokollet att föredra på grund av minskad embryo komprimering. Dessutom har minskat embryo kompression med användning av droppe protokollet följden av att presentera den runda, icke snedvriden ytan av embryot medan sandwiching tekniken innebär en tillplattad yta. När du använder konfokalmikroskopi det är därför nödvändigt att samla en bredare Z-stack (mer skivor per bunt) när du använder droppe protokollet kontra sandwiching metoden. Det ökade antalet skivor per Z-stack, ökar emellertid förvärvet tid samt eventuella foto-toxicitet eller foto-blekning i samband med laser excitation. Det är uppenbart att den experimentella resultat med anknytning reducerad kompression något kompenseras av en ökning av Z-stack förvärvet gånger. Trots denna ökning i Z-stack förvärvet tid, har vi dock observerade utmärkt bärkraft embryon med droppe protokollet.
Den droppe Protokollet är också begränsad till observation av embryon genom fluorescensmikroskopi, där ljusstrålen av händelsen och utsänt ljus inte går genom live-imaging kammare. Live-imaging embryon med DIC mikroskopi eller andra icke-fluorescens optik skulle kunna uppnås genom att modifiera live-imaging kammaren för att en lätt väg från kondensorn genom suspenderade embryot.
Ett problem när du använder droppe tekniken kan vara oönskade rörelser eller "drev" av embryon i synfältet under Timelapse förvärvet. När flytande mot undersidan av den inverterade täckglas, finner vi att embryona anmärkningsvärt stabila och inte flytta på plats vid användning av antingen torrt eller olja mål nedsänkning. Multipoint Timelapse förvärv med hjälp av en motordriven mikroskop skede inte heller störa positioner embryon som är beredda att använda droppe protokollet. Varje förflyttning av embryon upprättats enligt droppe tekniken kan elimineras genom att minska storleken på Halocarbon olje droppe och se till att separata oljedroppar inte smälta eller fuktspridande längs kanten av live-imaging kammarens bra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt stöd till BHR genom en Discovery Grant samt ett verktyg för forskning och instrumentet ge från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC). Vi erkänner också H. Oda och Bloomington Drosophila beståndet Center för att ge genetiska bestånd som användes i exemplet Bildproduktion sekvenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 μl. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
References
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
