הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Summary

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

Abstract

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מבוססי timelapse לחיות הדמיה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד תקנה הגנטי של תהליכים דינמיים כגון המורפוגנזה רקמות, תאים תאים הידבקות, או מוות של תאים. עוברים תסיסנית להביע GFP הם צילמו בקלות או באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או confocal. המטרה של כל פרוטוקול לחיות הדמיה היא למזער השפעות מזיקות כגון התייבשות היפוקסיה. פרוטוקולים קודמים להכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה יש מעורב הצבת עוברים dechorionated בשמן halocarbon ו הרבדה אותם בין halocarbon גז קרום חדיר ו coverslip

Protocol

הכנה

1. איסוף עוברים על מיץ ענבים רגיל צלחות אגר ^4. זה נוח להשתמש אוטומטית תסיסנית ביצה אספן (Flymax ציוד מדעי בע"מ). שימוש סינכרוני מבוים אוספים העובר יהיה להפחית את מספר dechorionations כי יש לבצע כדי להשיג מספרי נאותה של עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי.
2. הכן שקופית dechorionation ידי הצמדת נייר דבק דו צדדית לשקופית מיקרוסקופ; להסיר את הגיבוי מהקלטת.
3. הכינו את חדר הדמיה חיים על ידי חיתוך פיסת רקמה להשתלב היטב את החדר. מניחים את הרקמה הבאר רטוב עם מים מזוקקים.
4. Halocarbon מערבבים שמן (Halocarbon מוצרים קורפ) צמיגות סדרה 700 ו סדרה 56 ביחס של 1:01. התערובת ניתן לאחסן ולהשתמש בהם ללא הגבלת זמן.
5. מניחים כמה טיפות קטנות של שמן halocarbon על פני השטח של coverslip (22 X 40 מ"מ, מס '2). הנפח לא קריטי אבל צריך להיות בסדר גודל של μl 20-40.

נוהל

1. בעזרת stereomicroscope, לאסוף עוברים מן מיץ ענבים צלחות אגר או באמצעות זוג מלקחיים של צורף (מס '5) או מברשת צבע יפה מאוד. עוברים נוטים להיצמד זה לזה טיפים של מלקחיים, הם התכנסו בקלות גושים.
2. בעזרת stereomicroscope, בעדינות להוריד את גושי עוברים שיש להם דבק בקצות מלקחיים על פני השטח של הסרט בשקופית dechorionation.
3. שוב באמצעות stereomicroscope, בעדינות דחיפה או שבץ עוברי עם הצד של מלקחיים על מנת לפרוץ את סיסית דונגי החיצוני ללא פקיעת הקרום הפנימי vitelline (העובר יתפוצץ אם קרום vitelline מקרע).
4. לאחר סיסית החיצוני כבר מקרע, להקניט את העובר מן סיסית, העובר dechorionated נוטה לדבוק פני השטח של מלקחיים. תשמרי על עצמך כדי להימנע מלגעת העובר dechorionated לפני השטח של הסרט.
5. ברגע העובר הוא dechorionated, במהירות ולהעביר אותו עד טיפת הכין בעבר שמן halocarbon על coverslip. מגע קצה של מלקחיים נושאת את העובר dechorionated אל פני השטח של טיפת שמן halocarbon - זו מזיזה את העובר מן מלקחיים לתוך השמן.
6. אישור העברה של העובר עד טיפת שמן. ניתן לעשות זאת בעין בלתי מזוינת ובלבד שאתה עובד על רקע שחור להשתמש במקור סיבים אופטיים תאורה להגדיר בזווית אלכסונית.
7. לפני שתנסה dechorionate אחר העובר, לנקות שמן מלקחיים. מלקחיים מצופה בשמן יש לרכוש פחות על פני השטח סיסית, מה שהופך dechorionation קשה יותר.
8. עוברים Dechorionated הם קליל בשמן halocarbon. באמצעות מלקחיים או מכחול תוך צפייה דרך stereomicroscope, לדחוף את העובר אל החלק התחתון של טיפת שמן ומסדרים אותו למיקום הרצוי.
9. מהר להפוך את coverslip מעל הבאר של החדר הדמיה לחיות. ודא העוברים נחים נגד coverslip בכיוון הרצוי. בשל הציפה שלהם בשמן, העוברים כעת לצוף על פני השטח התחתון של coverslip. תקן את coverslip לחדר הדמיה לחיות עם הקלטת. לאוורר את החדר על ידי חיתוך חורים הקלטת באזור שבו הקלטת משתרע על פני הפער בין סוף coverslip ואת הקצה של הבאר של החדר הדמיה לחיות.
10. מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף או stereomicroscope הקרינה כעת ניתן להשתמש לתמונה עוברים.

Discussion

אנו מתארים שיטה חדשה להכנת עוברים תסיסנית לניתוח הדמיה לחיות, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי. למרבה הצער, לא ניתן להשתמש בפרוטוקול ירידה תלוי אם עובדים עם מיקרוסקופ הפוכה. במקרה זה הטכניקה הרבדה (כפי שתואר לעיל מופשט) יש להשתמש דחיסה של עוברים שרידים דאגה.

בניסויים שבהם צורת התא ואת גודל נמדדים על מנת לחשב את הכוחות הקשורים לתנועת המוךפו"גנטי שהולך, שימוש במיקרוסקופ זקוף פרוטוקול טיפה תלויה היא בגלל דחיסה עדיפה על העובר מופחת. כמו כן, דחיסה מופחת לעובר באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי יש תוצאה של הצגת משטח עגול, מעוותת של העובר בעוד טכניקה הרבדה מציג משטח שטוח. בעת שימוש מיקרוסקופיה confocal היא, אם כן, יש צורך לאסוף רחבה Z-מחסנית (פרוסות יותר לכל מחסנית) כאשר באמצעות פרוטוקול ירידה לעומת תלוי בשיטת הרבדה. מספר גדל של פרוסות לכל מחסנית-Z, לעומת זאת, עליות זמן הרכישה וכן רעילות תמונה או צילום הלבנת הקשורים עירור הלייזר. ברור לטובת הניסוי קשור דחיסה מופחת היא לקזז במקצת על ידי עלייה Z-מחסנית פעמים הרכישה. למרות הגידול הזה בזמן Z-מחסנית הרכישה, עם זאת, ראינו הכדאיות מעולה של עוברים באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי.

פרוטוקול הירידה תלוי מוגבל גם תצפית של העוברים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שבו נתיב האור של האירוע האור הנפלט אינו עובר תא חי הדמיה. Live-דימות באמצעות מיקרוסקופ עוברים DIC או אחרים שאינם אופטיקה הקרינה ניתן להשיג על ידי שינוי התא החי הדמיה כדי לאפשר נתיב האור הקבל דרך העובר על תנאי.

חשש בעת שימוש בטכניקה ירידה תלוי יכול להיות תנועה לא רצויה או "מרחפים" של העוברים בשדה הראייה במהלך הרכישה timelapse. כאשר צף כנגד התחתון של coverslip הפוכה, אנו מוצאים כי העוברים הם להפליא יציבה לא שינוי המיקום בעת שימוש או יבש או טבילה מטרות שמן. Multipoint רכישת timelapse באמצעות מיקרוסקופ ממונע הבמה גם לא לשבש את העמדות של עוברים, כי הם מוכנים באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי. כל תנועה של עוברים מוכן באמצעות טכניקה ירידה תלוי ניתן למנוע על ידי צמצום גודלו של טיפת שמן halocarbon ולהבטיח כי טיפות שמן נפרדים אינם פיוזינג או הפתילה בשולי חיים הדמיה קאמרית בסדר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides
coverslips (22 x 40 mm, No. 2)
double-sided tape
jeweller’s forceps (Dumont style No. 5)
halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.)
a utility knife or single edge razor blade
tissue paper
scissors
distilled water
general purpose tape
a pipet suitable for delivering 20-40 μl.
The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required.