从胚胎斑马鱼和cDNA合成的基因表达分析的RNA分离

Summary

孤立的高品质，完整的RNA是一个必不可少的步骤在许多实验室的协议。在这里，我们从整个斑马鱼的胚胎，随后应用在各种实验程序，包括基因表达芯片分析cDNA合成RNA的提取证明。

Abstract

许多重要和复杂的实验室的程序，要求输入的高品质，完整的RNA。降级样品或杂质的存在可能导致灾难性的结果在下游的实验应用。因此，最重要的，使用坚实的技术与众多的保障措施和质量控制检查，以确保卓越的样本。在此，我们详细的协议隔离使用市售的化学变性和随后的清理，以去除DNA和使用商业RNA提取试剂盒杂质的痕迹，从整个斑马鱼胚胎的总RNA。作为RNA相对不稳定和轻松容易由核糖核酸酶裂解，大多数协议检测基因表达的cDNA的产品，是直接从RNA为模板合成。我们详细的程序转换成更稳定的cDNA使用市售的套件产品的RNA。纵观这些程序有多项质量控制检查，以确保样品不退化或受到污染的的。这些协议的最终产品是基因，是适合的芯片分析，RT - PCR或长期储存。

Protocol

第1部分：用Trizol试剂提取总RNA

当工作与RNA是非常重要的工作的环境中，无RNase的。简单的预防措施，如只使用RNA的程序保留移液器和喷涂工作区开始的程序之前，用去污剂试剂（例如，核糖核酸酶客队）是非常有益的。

1. 在1.5 ml离心管要达到一个足够量的RNA池50个斑马鱼的胚胎，并删除尽可能多的水，用移液器。
2. 立即加入TRIzol试剂¹ 250μL到离心管中含有胚胎。 TRIzol试剂含有苯酚，只应根据通风柜使用。
3. 裂解及均质颗粒杵（约20杆）的胚胎，直到该组织是充分打乱。
4. 当细胞有足够的匀浆，加750μLTRIzol试剂等于1毫升的总量。
5. 要允许完整的核蛋白复合物的解离，孵化匀浆样品在室温下5分钟。在这个阶段，样本可闪光灯液氮冷冻和储存于-80 ° C或协议可以继续。
6. 要继续加0.2毫升氯仿和15秒，混合岩管。
7. 孵育样品在室温下2分钟，然后离心15分钟，在12000 XG 4 ° C。
8. 混合物分离成一个较低的红色的酚 - 氯仿相，相间，一种无色的上层水相。上层水相包含的RNA。顶层应包括TRIZOL（约0.6毫升）的初始体积约60％。转移到一个新的离心管，用1毫升吸管小心，不转让任何相间层顶部的水层。
9. 沉淀的RNA添加0.5毫升异丙醇。
10. 允许样品在室温下坐10分钟，然后离心10分钟样品在12000 XG在4 ° C。 RNA的试管底部形成凝胶颗粒。
11. 互不干扰沉淀，去除上清液，用吸管和1毫升75％乙醇洗涤沉淀。混合5分钟的样品轻轻翻转，并在7500 XG离心机在4 ° C。
12. 离心后，取出吸管乙醇和样品干倒10分钟时，。
13. 加入100μL无RNase水重悬沉淀和孵化的样品在55℃下10分钟。建议经常手指孵化过程中，以帮助RNA的补液的旋涡。或者，您可以使用NanoDrop ND - 1000分光光度计检查样品的质量和数量，或直接继续下一步。

第2部分：RNA清理使用Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒

² Qiagen公司的RNeasy试剂盒是在消除从其他方法中分离出的RNA样品中的污染物和杂质非常有用。对于此过程中，β-巯基乙醇，乙醇，无核酸酶水需要除了在该套件中包含的组件。在此过程中一个可选的DNA酶处理建议。

1. 第一次使用的试剂盒后，缓冲区RPE细胞将需要4卷100％的乙醇加入1体积缓冲区的RPE的准备。
2. 在一天的过程中，缓冲器的RLT将需要准备新鲜。计算总额将需要缓冲区的RLT。每个样品350μL的体积需要。要准备的缓冲区的RLT，添加10μLβ-巯基乙醇，每1毫升的缓冲。这项工作应根据通风柜。
3. 每个样本缓冲区的RLT 350μL和250μL100％的乙醇添加。拌匀移液器向上和向下几次。
4. 转移的样本，应约700μL的RNeasy列是在8000 XG 1分钟，在室温下放置在2毫升收集管和离心机，。
5. 离心后，弃流，并添加700μL缓冲液RW1的RNeasy旋转列。
6. 离心1分钟，在室温下在8000 XG样本，然后丢弃流过。
7. DNA酶治疗Qiagen公司无RNase的DNA酶试剂盒：DNA酶处理是可选的，但强烈建议提供最高质量的样品。
   1. 当你第一次收到的DNA酶处理工具包，你将需要准备，加入550μL无核酸酶水的DNA酶的DNA酶我原液。轻轻混匀反相和不旋涡。分装成单次使用小瓶含10μL原液。您可以储存在-20 ° C至9个月股市的解决方案。解冻分装在4 ° C的6个星期，如果需要，可以存储，但不重新冷​​冻解冻后的等份。
   2. 为了准备DNA酶我孵化混合，加入70μL缓冲RDD的10μLDNA酶I S滴答每个样品的解决方案。轻轻颠倒离心管混合简要收集残留的液体形式，管的两侧。直接添加80μLDNA酶我孵化组合的RNeasy旋转列。孵育30分钟，在室温下的DNA酶处理。
8. 继DNA酶处理，添加350μL缓冲液RW1离心柱和离心1分钟，在室温下在8000 XG。
9. 离心后丢弃的流量通过，并添加500μL缓冲的RPE自旋列。孵育样品在室温下5分钟。
10. 离心1分钟，在室温下在8000 XG的样品和丢弃的流量通过。
11. 离心后加入500μl75％乙醇的离心柱。
12. 在8000 XG重复离心，但在室温下2分钟。
13. 离心后丢弃的流量，并允许该列干5分钟。
14. 立即在室温下离心8000 XG删除任何乙醇的痕迹，左5分钟。
15. 离心后是完全转移到一个新的1.5 ml收集管中的自旋列，并添加10μL无核酸酶水。孵育1分钟，然后离心1分钟，在室温下以10,000 XG。的RNA，将在流通过。
16. 添加另一种无核酸酶水10μL的离心柱和在室温下孵育1分钟。离心样品在室温下1分钟XG 10,000。
17. 离心后取出并丢弃离心柱。 RNA将流通过。
18. 检查RNA的数量和质量，按照制造商的说明使用一个NanoDrop ND - 1000分光光度计。
19. 此外，运行变性凝胶或使用安捷伦2100生物分析仪检查RNA的完整性。
20. 样品应保存于-80℃直至可以进行cDNA合成。

第3部分：使用Invitrogen公司标的第一链系统的cDNA合成

RNA是轻松容易导致退化的核糖核酸酶裂解。因此，许多基因表达的协议，已经发展到使用一个更加稳​​定，已经直接从RNA合成cDNA产物。在这里，我们详细的合成第一链的cDNA用Invitrogen公司标第一链合成系统^3。每个cDNA合成反应，最多可容纳5微克的RNA。

1. 在开始的程序组合，并短暂离心​​每个组件。
2. 准备RNA /引物混合在无菌的0.5 ml离心管如表1所列。
3. 孵育65℃，5分钟的样品。
4. 10分钟，立即转移样品冰浆。
5. 当样品冷却准备一个与表2中所述的组件的主结构。卷列出每1反应。总数的反应，相应调整卷。
6. 冷却后，加上9日在第5步准备每个RNA /引物混合物的预混液。轻轻混匀后短暂离心收集。每个样品总量应为19μL。
7. 在42 ° C孵育2分钟，在热循环样品。
8. 标二RT 1μL（50个单位）添加到每个管，混合，并孵育42 ° C为60分钟，在热循环。
9. 终止反应，在70 ° C下15分钟，然后寒意样品到4 ° C。步骤8和9可以编程为一个热循环。
10. 后的样品已达到4℃，反应转移到冰浴。
11. 在冰上，每管加1μl的RNase H的和20分钟在37 ° C。总体积21μL。核糖核酸酶H添加到您的样品会降低RNA为模板，并留下唯一的单链cDNA产物。

第4部分：基因的分离和降水

1. 1.5 ml的锁相硅胶管将用于在隔离的cDNA产品。离心2分钟，在12000 XG准备1.5毫升锁相硅胶管。凝胶都应该在试管底部。
2. 锁相凝胶管中加入81.5μL酚（三饱和，缓冲pH值8.0），81.5 24:1的氯仿异戊醇液，样品（21微升）。轻轻颠倒混合数次。
3. 在12000 XG离心样品在室温下5分钟。
4. cDNA的，应在上层水相。转移到一个干净的1.5 ml离心管上部阶段。总体积约20μL。
5. 添加1X量的3 M NaOAc，pH值5.2，轻轻混匀。例如，如果上层水相的体积等于20μL，您将需要添加2μL3 M NaOAc，pH值5.2。
6. 新增7μL5 mg / ml的糖原，轻轻混匀。
7. 加入1倍体积的异丙醇，轻轻混匀。一般来说，这是约30μL异丙醇。
8. 允许样品在室温temperatur孵育离心12000 XG E为10分钟，然后在室温下20分钟。
9. 一个小的cDNA颗粒的试管底部形成。用移液器小心取出上清液。
10. 加入500微升70％的乙醇混合反演。
11. 离心5分钟，在12000 XG样品。
12. 离心后去除上清，用移液器重复的70％乙醇洗涤，离心（步骤10和11）。
13. 离心后除去上清液用移液器。如果有液体管双方的剩余，它可以收集简要纺纱管。删除任何多余的液体，使沉淀在室温下干燥5分钟。
14. 加入20μL无核酸酶水，补充水分颗粒。 5分钟补液颗粒的样品放置在55 ° C。
15. 然后检查以下制造商的说明使用一个NanoDrop ND - 1000分光光度计的cDNA产品的数量和质量。可以储存在-20 ° C的cDNA

代表性的成果

RNA的清理后，约15微克的高品质总RNA可以预期从50个斑马鱼的胚胎。为了评估总RNA质量，分光光度仪，凝胶电泳，和Agilent 2100生物分析仪可以使用。一个NanoDrop ND - 1000分光光度计可用于评估在260 nm处的吸光度在280 nm（图1）相比的吸光度。 ₂₆₀ / ₂₈₀的比例可以揭示污染物的存在，并给予可能的退化的证据。一个₂₆₀ / ₂₈₀比例的1.9-2.0认为是可接受的。此外，强烈建议RNA变性凝胶运行评估RNA的完整性。 RNA链将单独对它们的大小的基础上，用较小的股进一步下跌的凝胶迁移。会出现一个非退化的样本作为涂抹两强带。涂片是一个人口大小不同的mRNA链的结果，对应28S和18S rRNA的条带。 28S乐队应该是18S条带（图2）激烈的两倍左右。另外，总RNA的完整性，可以使用Agilent 2100生物分析仪进行评估。两个明显的峰值，代表28S和18S rRNA预期（图3）。 28S峰值应大于18S根据峰面积峰值，​​分别约为2:1。两个明显的峰值，不会退化样品观察。参展降解的RNA样品，不应该通过随后的实验步骤进行。

分光光度分析可用于评估的cDNA产品质量（图4）。 ₂₆₀ / ₂₈₀应该是1.8左右。输入5μg总RNA的cDNA反应经常在我们的实验室中产生的cDNA产品的1-2微克。

图1。 RNA的清理后的RNA样品NanoDrop的光谱 。，RNA的数量和质量进行评估使用NanoDrop ND - 1000分光光度计。高质量的总RNA中，约15微克， _是常规₂₆₀ / 280左右1.9-2.0的比例从50斑马鱼的胚胎产生。

图2的RNA变性凝胶要评估的总RNA的分离完整性，RNA变性凝胶可以跑。预计涂抹与相应的28S和18S rRNA的两个明亮的条带。 28S乐队应该是18S乐队激烈的大约两倍。

图3。样本的RNA样品的跟踪，从生物分析仪。评估的总RNA的完整性，可能还可以在Agilent 2100生物分析仪分析。两个尖锐的峰，对应的28S和18S rRNA，应该是可见的的。 28S峰值应大于18S根据峰面积峰值，​​分别约为2:1。

图4。一个NanoDrop频谱的cDNA样本。光度法分析与NanoDrop ND - 1000可用于评估的cDNA产品的数量和质量。 ₂₆₀ / ₂₈₀的比例应在1.8左右。输入5微克总RNA的cDNA反应，经常产生1-2微克的cDNA在我们的实验室。

表1。元件RNA /引物混合物添加在合成cDNA的第2步。

组件	卷
总RNA（5微克）	10μL
10毫米dNTP混合液	1μL
以oligo（dT）12-18（0.5μg/μL的）	1μL
DEPC处理过的水	ñμL
总成交量	10μL

表2。cDNA合成的第5步反应混合物。卷列出的每个反应。每个组件数量增加总数的反应。

组件	卷
10X RT缓冲	2μL
25 mM的氯化镁	4μL
0.1 mM的数码地面电视	2μL
RNAseOUT	1μL

Discussion

RNA分子的脆弱性是最重要的考虑因素，应成为本议定书记住。应始终使用无菌设备，无RNase在实验室无RNase区。储备的只适用于RNA的程序实验室的一部分，它是有帮助的。核糖核酸酶去除产品，如核糖核酸酶，远离此区域应经常喷洒。 RNA样本应始终带手套处理，并放在冰上，防止退化。

该协议利用市售的试剂和试剂盒。另外，还有许多额外的试剂和RNA分离试剂盒，市场上可用于总RNA隔离。此协议中包含的试剂和试剂盒的运作良好，并经常在我们的实验室产生高质量的RNA。

作为替代方案，进行双链cDNA的合成，而不是在本议定书中表现出的第一链合成。双链cDNA的是有时想要的，因为它提供了更高的稳定性。此外，有些协议需要双链cDNA的产品作为输入。但是，如果样品要保持在下游应用的房子，第一链合成就足够了，是更为经济。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026