Summary
Изоляция высокого качества, нетронутыми РНК является важным шагом для многих лабораторных протоколов. Здесь мы демонстрируем выделения РНК из целых эмбрионов данио рерио и синтеза кДНК для последующего применения в различных экспериментальных процедур, включая анализ генных микрочипов выражения.
Abstract
Много важных и сложных лабораторных процедур требуется ввод высокого качества, нетронутыми РНК. Деградированных образцов или наличие примесей может привести к катастрофическим результатам в нижнем течении экспериментальных приложений. Поэтому, крайне важно использовать твердые методы с многочисленными гарантии и контроль качества для обеспечения превосходной образца. В этом мы подробно протокол, чтобы изолировать общей РНК из целых эмбрионов данио использованием коммерчески доступных денатуранта химической и последующей очистки, чтобы удалить следы ДНК и примесей с использованием коммерческого изоляции РНК комплект. Как РНК является относительно нестабильной и легко склонны к расщеплению РНКазы, большинство протоколов анализа экспрессии генов использованием кДНК продукт, который непосредственно синтезируется из матричной РНК. Мы подробно процедуру для преобразования РНК в более стабильные кДНК продукта с использованием коммерчески доступных комплектом. На протяжении всех этих процедур Существуют многочисленные проверки контроля качества, чтобы убедиться, что образец не деградировали или загрязненной. Конечным продуктом этих протоколов кДНК, которая подходит для анализа микрочипов, RT-PCR или долгосрочного хранения.
Protocol
Часть 1: Добыча Всего РНК с использованием реагентов TRIzol
При работе с РНК, очень важно работать в среде, свободной от РНКазы. Простые меры предосторожности, такие как наличие защищены пипетки для использования только с процедурами, РНК и распыления рабочей зоны с деконтаминант реагента (например, РНКазы Away) перед началом процедуры очень полезны.
- Для достижения достаточного количества РНК бассейн 50 эмбрионов данио в 1,5 мл трубки микроцентрифужную и удалить столько воды, сколько возможно с пипеткой.
- Сразу же добавить 250 мкл реагента TRIzol 1 до микроцентрифужную трубку с эмбрионами. TRIzol реагент содержит фенол и должны использоваться только под вытяжкой.
- Lyse и гомогенизировать эмбрионов с пестиком гранулы (около 20 ударов), пока ткань достаточно нарушена.
- Когда клетки достаточно усредненный, добавьте 750 мкл реагента TRIzol равным суммарным объемом 1 мл.
- Чтобы разрешить полной диссоциации нуклеопротеида комплексов, инкубировать гомогенизированных образцов в течение 5 минут при комнатной температуре. На данном этапе, образец может быть глубокой заморозки в жидком азоте и хранили при -80 ° С или протокол может быть продолжена.
- Чтобы продолжить добавить 0,2 мл хлороформа и рок-трубки в течение 15 секунд, чтобы смешаться.
- Инкубируйте образца в течение 2 минут при комнатной температуре, а затем центрифуге при 12 000 мкг в течение 15 минут при 4 ° C.
- Смесь будет разделяться на нижней красной фенол-хлороформ фазы, межфазного и бесцветной верхней водной фазы. Верхняя водная фаза содержит РНК. Верхний слой должен состоять из примерно 60% от первоначального объема TRIzol (около 0,6 мл). Передача верхнего водного слоя в новую трубку микроцентрифужную использованием 1 мл пипетки тем, чтобы не передавать какие-либо межфазного слоя.
- Чтобы осадок РНК добавить 0,5 мл изопропанола.
- Разрешить образец сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем центрифуги образца при 12 000 мкг в течение 10 минут при 4 ° C. РНК образуют гелеобразные гранул на дне трубки.
- Не нарушая гранул, удалить супернатант с пипеткой и промыть осадок в 1 мл 75% этанола. Смешайте образца нежный инверсии и центрифуге при 7500 мкг в течение 5 минут при 4 ° C.
- После центрифугирования, удаления этанола с пипетки и позволить образец сухой в то время как перевернутая на 10 минут.
- Ресуспендируют гранул путем добавления 100 мкл РНКазы без воды и инкубировать образца при 55 ° С в течение 10 минут. Рекомендуется пальцем вихрь часто во время инкубации, чтобы помочь в регидратации РНК. По желанию, вы можете проверить качество образца и количество использованием NanoDrop ND-1000 спектрофотометр или непосредственно перейти к следующему шагу.
Часть 2: РНК Очистка использованием Qiagen RNEasy Mini Kit
Qiagen RNEasy Mini Kit 2 полезна в удалении загрязнений и примесей из образцов РНК, выделенной из других методов. Для этой процедуры, β-меркаптоэтанол, этанола и нуклеазы без воды необходимы в дополнение к компоненты, входящие в комплект. Дополнительного лечения ДНКазы рекомендуется во время этой процедуры.
- После первого использования комплекта, Буфер НПП должны быть получены путем добавления 4 тома из 100% этанола на 1 объем буфера ППД.
- В день процедуры буфера RLT необходимо быть готовым свежим. Рассчитать общую сумму буфера RLT, которые будут необходимы. Объем 350 мкл необходимо на один образец. Для подготовки буфера RLT, добавить 10 мкл β-меркаптоэтанол на каждый 1 мл буфера. Это должно быть сделано под вытяжкой.
- Для каждого образца добавить 350 мкл буфера RLT и 250 мкл 100% этанола. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Передача образца, которая должна быть примерно 700 мкл, в RNEasy столбца, который находится в 2 мл трубки сбора и центрифуге при 8000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- После центрифугирования, отбросить поток через и добавить 700 мкл буфера для RW1 RNEasy колонке спина.
- Центрифуга образца 8000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре, а затем отказаться от потока через.
- ДНКазы лечение Qiagen РНКазы, свободной от ДНКазы Kit: ДНКазы лечение не обязательно, но рекомендуется для высоких образцов качества.
- Когда Вы получили комплект ДНКазы лечения, вам необходимо подготовить запас ДНКазы я решение путем добавления 550 мкл нуклеазы без воды ДНКазы. Осторожно перемешать путем обращения и не вихря. Алиготе в единую флаконах использования, содержащие 10 мкл исходного раствора. Вы можете хранить маточного раствора при температуре -20 ° С до 9 месяцев. Талой аликвоты можно хранить при 4 ° С в течение 6 недель, если это необходимо, но не замораживать порциями после размораживания.
- Для подготовки инкубации ДНКазы Я смешиваю добавить 70 мкл буфера RDD до 10 мкл ДНКазы я сТок раствора на образце. Смешать, осторожно инверсии и центрифужную пробирку кратко собрать остаточной жидкой форме стороны трубы. Добавить 80 мкл ДНКазы я инкубации смеси непосредственно к RNEasy колонке спина. Инкубируйте лечения ДНКазы в течение 30 минут при комнатной температуре.
- После лечения ДНКазы добавить 350 мкл буфера RW1 в колонну спина и центрифуге при 8000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- После центрифугирования отказаться от потока через и добавить 500 мкл буфера для НПП спин колонки. Инкубируйте образца в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Центрифуга образца 8000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре и отказаться проходить через.
- После центрифугирования добавить 500 мкл 75% этанола, спина колонке.
- Повторите центрифугированием при 8000 мкг, но в течение 2 минут при комнатной температуре.
- После центрифугирования отказаться от потока через и позволяют колонке высохнуть в течение 5 минут.
- Сразу центрифуге при 8000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить оставшиеся следы этилового спирта.
- После центрифугирования является полным переносом спина колонку в новой коллекции трубки 1,5 мл и добавляют 10 мкл нуклеазы без воды. Инкубируйте в течение 1 минуты, а затем центрифуге при 10 000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре. РНК будет течь через.
- Добавьте еще 10 мкл нуклеазы без воды спин колонки и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 минуты. Центрифуга образца при 10 000 мкг в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- После центрифугирования удалить и уничтожить спин колонки. РНК будет течь через.
- Проверка качества и количества РНК с использованием NanoDrop ND-1000 спектрофотометр следуя инструкциям производителя.
- Кроме того, работать денатурирующих гель или использование Agilent 2100 bioanalyzer проверить целостность РНК.
- Образцы должны храниться при температуре -80 ° C до синтеза кДНК может быть выполнена.
Часть 3: Синтез кДНК использованием Invitrogen Надстрочный первого Strand системы
РНК легко склонны к расщеплению РНКазы, ведущие к деградации. В результате многие протоколы экспрессии генов были разработаны с целью использования более стабильной кДНК продукт, который был непосредственно синтезировать из РНК. Здесь мы подробно синтез первой цепи кДНК использованием Invitrogen Надстрочный первого Strand Синтез системы 3. Каждый кДНК реакции синтеза могут разместиться до 5 мкг РНК.
- Перед началом процедуры смешивания и кратко центрифуги каждого компонента.
- Подготовка РНК / грунтовки смеси в 0,5 мл стерильного микроцентрифужную трубки, как указано в таблице 1.
- Инкубируйте образца при 65 ° С в течение 5 минут.
- Сразу передачи образца льда суспензии в течение 10 минут.
- В то время как образец охлаждения подготовить мастер смешать с компонентами, изложенных в таблице 2. Объемы приведены на 1 реакции. Отрегулируйте объемы, соответственно, для общего числа реакций.
- После охлаждения добавить 9 мкл мастер смесь подготовлена в шаге 5 к каждому РНК / грунтовки смеси. Осторожно перемешать и собрать краткие центрифугирования. Общий объем каждого образца должно быть 19 мкл.
- Инкубируйте образца при 42 ° С в течение 2 минут в амплификаторе.
- Добавить 1 мкл (50 единиц) Надстрочный II RT в каждую пробирку, перемешать и инкубировать при 42 ° С в течение 60 минут в амплификаторе.
- Завершить реакции при 70 ° С в течение 15 минут и затем охладите образец до 4 ° C. Амплификаторе может быть запрограммирован на шаги 8 и 9.
- После того как образец достиг 4 ° C, передачи реакции на ледяной бане.
- На льду добавить 1 мкл РНКазы Н в каждую пробирку и инкубировать в течение 20 минут при температуре 37 ° C. Общий объем в настоящее время 21 мкл. Добавление РНКазы H, чтобы ваш образец будет деградировать матричной РНК и оставить только одну цепь кДНК продукта.
Часть 4: кДНК Выделение и осадки
- 1,5 мл фазовой автоподстройки гель трубка будет использоваться в изоляции кДНК продукта. Подготовка 1,5 мл фазовой автоподстройки гель трубки центрифугированием при 12 000 мкг в течение 2 минут. Гель все должны быть в нижней части трубы.
- Добавить 81,5 мкл фенола (Трис-насыщенным, буфером до рН 8,0), 81,5 мкл 24:1 алкоголя хлороформ изоамиловый и выборка (21 мкл) в гель трубки Блокировка фазы. Смешайте несколько раз нежно инверсии.
- Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
- КДНК должно быть в верхней водной фазы. Передача верхней фазы в чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Общий объем должен быть около 20 мкл.
- Добавить 1X объема 3 М NaOAc, рН 5,2 и аккуратно перемешать. Например, если объем верхней водной фазы, равной 20 мкл, вам нужно будет добавить 2 мкл 3 М NaOAc, рН 5,2.
- Добавить 7 мкл 5 мг / мл гликогена и аккуратно перемешать.
- Добавить 1X объем изопропанола и аккуратно перемешать. Обычно это около 30 мкл изопропанола.
- Разрешить образец для инкубации при комнатной температурэлектронной течение 10 минут, а затем центрифуге при 12000 мкг в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Небольшой шарик кДНК должны формировать на нижней части трубы. Осторожно удалите супернатант с пипеткой.
- Добавить 500 мкл 70% этанола и микс от инверсии.
- Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 5 минут.
- После центрифугирования супернатант удалить с помощью пипетки и повторите 70% этанола и мыть центрифугирования (шаги 10 и 11).
- После центрифугирования супернатант удалить с пипеткой. Если есть жидкость оставшиеся по бокам трубки, она может быть собрана кратко спиннинг трубы. Удалите излишки жидкости и позволяет гранул высохнуть при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Добавьте 20 мкл нуклеазы без воды увлажняет гранул. Место образца при 55 ° C в течение 5 минут для регидратации гранул.
- Количество и качество кДНК продукт затем проверены с помощью NanoDrop ND-1000 спектрофотометр следуя инструкциям производителя. КДНК можно хранить при температуре -20 ° C.
Представитель Результаты
После очистки РНК, приблизительно 15 мкг высокой РНК общее качество можно ожидать от 50 эмбрионов данио. Для оценки общего качества РНК, спектрофотометр, гель-электрофореза, и Agilent 2100 Bioanalyzer могут быть использованы. NanoDrop ND-1000 спектрофотометр может быть использован для оценки оптической плотности при 260 нм по сравнению с поглощением при 280 нм (рис. 1). 260 / 280 соотношение может выявить наличие загрязняющих веществ и свидетельствуют о возможной деградации. 260 / 280 Отношение 1,9-2,0 считается приемлемым. Кроме того, настоятельно рекомендуется, чтобы гель РНК денатурации быть запущена для оценки РНК целостности. РНК нитей будет разделен на основании их размера, с более мелкими нити мигрируют дальше гель. Неискаженный образец будет выглядеть как мазать две сильные полосы. Мазок результате население разного размера нити мРНК и полосы соответствуют 28S и 18S рРНК. Группа 28S должна быть примерно в два раза интенсивнее 18S полосы (рис. 2). Кроме того, общая целостность РНК можно оценить, используя Agilent 2100 bioanalyzer. Две различные пики представляющих 28S и 18S рРНК, как ожидается, (рис. 3). Пик 28S должно быть больше, чем 18S пик с площади под пиками примерно 2:1, соответственно. Два различных пиков не будет наблюдаться на деградированных образцов. РНК образцы выставке деградации не должна осуществляться через последующие экспериментальные процедуры.
Спектрофотометрический анализ может быть использован для оценки качества кДНК продукта (рис. 4). 260 / 280 должна быть около 1,8. кДНК реакции с входом 5 мкг тотальной РНК обычно доходность 1-2 мкг кДНК продукта в нашей лаборатории.
Рисунок 1. NanoDrop спектр образцов РНК. После очистки РНК, РНК, количества и качества можно оценить, используя NanoDrop ND-1000 спектрофотометр. Около 15 мкг высокого качества общей РНК регулярно дали от 50 данио эмбрионов с 260 / 280 соотношение примерно 1,9-2,0.
Рисунок 2. Гель РНК денатурации. Для оценки целостности полной изоляции РНК, РНК гель денатурации может быть побежал. Смазать два ярких полос, соответствующих 28S и 18S рРНК не ожидается. Группа 28S должна быть примерно в два раза интенсивнее группы 18S.
Рисунок 3. Следа образца РНК из bioanalyzer. Для оценки целостности полной изоляции РНК, то пробы могут быть проанализированы на Agilent 2100 bioanalyzer. Два резких пиков, соответствующих 28S и 18S рРНК, должны быть видны. Пик 28S должно быть больше, чем 18S пик с площади под пиками примерно 2:1, соответственно.
Рисунок 4. NanoDrop спектр кДНК образца. Спектрофотометрический анализ с NanoDrop ND-1000 может быть использован для оценки количества и качества кДНК продукта. 260 / 280 соотношение должно быть около 1,8. кДНК реакции с входом 5 мкг тотальной РНК обычно доходность 1-2 мкг кДНК в нашей лаборатории.
Таблица 1. Компоненты добавить для РНК / грунтовка смесей при шаге 2 синтеза кДНК.
| Компонент | Объем |
| Всего РНК (до 5 мкг) | 10 мкл |
| 10 мМ дНТФ смеси | 1 мкл |
| Олиго (дТ) 12-18 (0,5 мкг / мкл) | 1 мкл |
| DEPC-очищенной воды | н мкл |
| Общий объем | 10 мкл |
Таблица 2. Реакционная смесь для шага 5 кДНК синтеза. Объем перечисленных в реакцию. Увеличение объемов каждого компонента на общее число реакций.
| Компонент | Объем |
| 10X Буфер РТ | 2 мкл |
| 25 мМ MgCl2 | 4 мкл |
| 0,1 мМ DTT | 2 мкл |
| RNAseOUT | 1 мкл |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хрупкость молекула РНК является наиболее важным внимание, что следует помнить на протяжении всего этого протокола. Стерильные оборудования, которое без РНКазы всегда должны быть использованы в РНКазы зоны, свободной от лаборатории. Это полезно, чтобы зарезервировать часть лаборатории, которые будут использоваться для процедур только РНК. Эта область должна быть часто опрыскивают РНКазы удаления продуктов, таких как РНКазы Away. РНК-проб должны быть всегда производить в перчатках и держал на льду, чтобы предотвратить деградацию.
Этот протокол воспользовался коммерчески доступных наборов реагентов и. Кроме того, Есть многочисленные дополнительные реагенты и РНК изоляции комплектов, доступных на рынке для полного выделения РНК. Наборов реагентов и включены в этот протокол работал хорошо и регулярно дали высокую РНК качества в нашей лаборатории.
В качестве альтернативы двухцепочечной кДНК синтеза может быть выполнена, вместо первого синтеза нити продемонстрировали в этом протоколе. Двухцепочечной кДНК иногда желаемое, поскольку он обеспечивает повышенную стабильность. Кроме того, некоторые протоколы требуют двухцепочечной кДНК продукты, как вход. Однако, если образцы будут храниться в доме для последующих применений, прежде всего синтез прядь достаточно и гораздо более экономичным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycogen (5 mg/ml) | Ambion | 9510 | |
| NanoDrop ND-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| Pellet Pestles with Microfuge Tube | VWR international | KT749520-0090 | |
| Phase Lock Gel Light, 1.5 ml | Eppendorf | 2302800 | |
| Phenol, Tris-saturated | Roche Group | 3117944001 | |
| RNAse Away | VWR international | 17810-491 | |
| RNAse-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNEasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 11904-018 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 |
References
- TRIzol Reagent Manual. , (2007).
- RNEasy Mini Handbook. , 4th ed, (2006).
- SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Version E. (2003).
