Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique
Summary
Nous présentons une<em> In vitro,</em> Deux couleurs dosage par fluorescence pour visualiser la fusion des particules de virus unique avec une bicouche cibles fluide. Par l'étiquetage des particules virales avec les fluorophores différentielle tacher la membrane virale et son intérieur, nous sommes en mesure de contrôler la cinétique de formation de pores et de hemifusion.
Abstract
La fusion membranaire est une étape essentielle lors de l'entrée des virus enveloppés dans les cellules. Dosages de fusion conventionnel généralement un rapport sur un grand nombre d'événements de fusion, ce qui rend difficile pour l'analyse quantitative de la séquence des étapes moléculaires impliqués. Nous avons développé une étude in vitro, deux couleurs de fluorescence test pour contrôler la cinétique des particules du virus de la fusion simple avec une bicouche cible sur un support sensiblement fluide.
Particules virales de la grippe sont incubés avec un fluorophore lipophile pour tache verte de la membrane et un fluorophore rouge hydrophile pour colorer l'intérieur virale. Nous déposons une bicouche lipidique contenant du ganglioside sur la surface du verre dextrane-functionilized d'une cellule d'écoulement, incuber les particules virales sur la bicouche planaire et l'image de la fluorescence d'une 100 x 100 um 2 zone, contenant plusieurs centaines de particules, sur un capteur CCD caméra. En imagerie à la fois la fluorescence rouge et verte, nous pouvons simultanément surveiller le comportement de la teinture de membrane (vert) et le contenu aqueux (rouge) des particules.
Après abaissement du pH à une valeur inférieure au pH de fusion, les particules vont fusionner avec la membrane. Hemifusion, la fusion de l'feuillet externe de la membrane virale avec le feuillet externe de la membrane cible, sera visible comme un changement soudain dans la fluorescence verte d'une particule. Lors de la fusion subséquente des deux autres tracts distal un pore sera formé et le fluorophore rouge émettant dans la particule virale sera publié sous la membrane cible. Cet événement donnera lieu à une diminution de la fluorescence rouge des particules individuelles. Enfin, la fluorescence d'un fluorophore intégrés sensibles au pH qui est incorporé dans la membrane cible des rapports sur l'heure exacte de la chute du pH.
De trois à fluorescence en temps des traces, tous les événements importants (chute du pH, de lipides de mixage sur hemifusion, mélanger le contenu à la formation de pores) peut maintenant être extraite d'une manière simple et pour chaque particule individuellement. En recueillant les temps écoulé pour les différentes transitions pour de nombreuses particules individuelles dans les histogrammes, nous pouvons déterminer la durée de vie des intermédiaires correspondantes. Même intermédiaires cachés qui n'ont pas une observable directement fluorescentes peuvent être visualisés directement à partir de ces histogrammes.
Protocol
Discussion
Préparation du fluide et continu bicouches lipidiques supportées peut être difficile. Des traces de contamination de défauts matériels ou de surface permettra d'éviter la propagation de bicouches. Nettoyage soigneux et dépôt d'une couche uniforme de dextrane sont essentiels.
Imagerie prolongée des particules de virus peuvent blanchir les marqueurs fluorescents ou les amener à devenir inactivé. Photo-dommages de ce type est bien connu dans la bio-imagerie et des champs mol?…
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par des subventions du NIH AI57159 (au SCH) et AI72346 (pour AMvO). SCH est un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
