Wir präsentieren einen In vitro, Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.
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Methodenartikel
Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen.
Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel.
Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall.
Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.
Protokoll
Deckglas Funktionalisierung
Die planare Doppelschicht in der Fusion-Assay verwendet wird, auf eine hydratisierte Film von Dextran unterstützt. Dextran dient als Abstandshalter zwischen den planaren Bilayer und Glasoberfläche. Dies verhindert Membran-Komponenten erst gar nicht auf der Glasoberfläche fest und bietet auch Raum in dem die Inhalte einer Virus-Partikel können auf Fusion zu entkommen. Deckgläser werden durch Behandlung mit einem Epoxysilan, die uns chemisch binden Dextran, das Glas (Elender, et al. 1996) ermöglicht funktionalisiert.
- Vereinbaren Sie 25 mm Deckgläschen in einer keramischen Färbebank und Platz i....
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Diskussion
Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich.
Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmolekül-Bere.......
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Danksagungen
Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Corning Deckgläser, quadratisch, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Schmelzsilizium-Scheiben | Technical Glass | ||
| Färbehalterung | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilan | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterin | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadekanoyl-sn-glycero-3-phosph–ethanolamin, Triethylammoniumsalz (Biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, mit Fluorescein konjugiert | Invitrogen | S-869 | |
| Disialogangliosid GD1a aus Rindergehirn | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Polycarbonat-Membranfilter, 0,1 Mikron | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10-mm-Abflussscheiben (Membranträger) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamin B-Natriumsalz | S1402 | ||
| Octadecylrhodamin 110 (Rh110C18) | Siehe Floyd et al. 2008 für den Syntheseprotokoll | ||
| PD-10-Desalting-Säulen | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon-Fluoreszenzmikroskop | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA Objektiv | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr-Laser | Coherent Inc. | ||
| Spritzenpumpe | Harvard Apparatus | 702213 |
Referenzen
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
