单颗粒水平病毒融合动力学的测量方法

摘要

我们提出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于可视化单个病毒颗粒与流动靶向双层膜的融合过程。通过使用可差异标记病毒膜及其内部结构的荧光染料对病毒颗粒进行标记，我们能够监测半融合及融合孔形成的动力学过程。

摘要

膜融合是包膜病毒进入细胞过程中的关键步骤。传统的融合检测方法通常报告大量融合事件，难以对其中涉及的分子步骤序列进行定量分析。我们已开发出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于监测单个病毒颗粒在近似流体支撑的双层膜上融合的动力学过程。

将流感病毒颗粒与一种绿色亲脂性荧光染料共同孵育以标记其膜结构，同时使用一种红色亲水性荧光染料标记病毒内部。我们在葡聚糖功能化的流动池玻璃表面沉积一层含有神经节苷脂的脂双层，将病毒颗粒孵育在平面脂双层上，并利用CCD相机对包含数百个病毒颗粒的100 × 100 μm²区域进行荧光成像。通过同时成像红色和绿色荧光，我们可以同步监测病毒膜染料（绿色）和病毒内部水相内容物（红色）的行为。

当pH降低至低于融合pH值时，颗粒将与膜发生融合。半融合，即病毒膜的外层小叶与靶膜的外层小叶合并，会表现为颗粒绿色荧光的突然变化。随后，两个剩余的远端小叶进一步融合，形成孔道，病毒颗粒内发射红色荧光的荧光染料将被释放至靶膜下方。该事件将导致单个颗粒红色荧光的减弱。最后，嵌入靶膜中的pH敏感型荧光染料所发出的整合荧光信号，可报告pH下降的确切时间。

从三条荧光-时间轨迹中，现在可以简便地逐个提取每个颗粒的所有重要事件（pH值下降、半融合时的脂质混合、孔形成时的内容物混合）。通过将大量单个颗粒各种转变所经历的时间收集到直方图中，我们可以确定相应中间态的寿命。即使是那些没有直接荧光信号可观测的隐含中间态，也可以直接从这些直方图中显现出来。

方案

盖玻片功能化

融合实验中使用的平面双层膜由一层水合葡聚糖薄膜支撑。葡聚糖在平面双层膜与玻璃表面之间起到间隔作用，防止膜组分粘附在玻璃表面，同时也为病毒颗粒融合后内容物的释放提供空间。通过环氧硅烷处理对玻璃盖玻片进行功能化修饰，可将葡聚糖化学键合至玻璃表面（Elender，et al. 1996）。

1. 将25 mm盖玻片排列在陶瓷染色架中，并将该架放入广口瓶或烧杯内。
2. 向容器中加入10%的实验室级玻璃器皿清洗剂溶液，将容器置于超声波清洗仪中清洗30分钟。
3. 用去离子水冲洗容器及盖玻片架，然后重新注入1 M氢氧化钾溶液。再次将容器放入超声波清洗仪中处理30分钟。
4. 依次使用丙酮和乙醇重复上述清洗步骤。
5. 用清水冲洗盖玻片并干燥。
6. 最后，使用氧气等离子体清洗仪对盖玻片处理3分钟。
7. 该最终清洗步骤可使表面氧化，从而使玻璃在后续的硅烷化步骤中具有均匀的亲水性和反应活性。
8. 配制0.2%的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷异丙醇溶液，将盖玻片浸入该溶液中5分钟。
9. 弃去硅烷溶液，并用异丙醇多次冲洗盖玻片。
10. 此时盖玻片表面已形成一层硅烷涂层，但需进行固化处理，以使硅烷与玻璃表面形成共价键。将盖玻片置于80°C的烘箱中加热1小时。
11. 在盖玻片固化的同时，称取葡聚糖500，配制30%（w/v）的溶液。预热去离子水有助于溶解。每片盖玻片约使用1 ml该溶液。葡聚糖完全溶解后，将其置于真空干燥器中脱泡。
12. 硅烷化处理后的盖玻片完成固化后，将其从陶瓷架上取下，并平铺于塑料冷冻盒内表面。使用1 ml移液器将约1 ml葡聚糖溶液均匀覆盖于每片盖玻片表面。盖上冷冻盒，静置24–36小时。
13. 用塑料镊子夹持盖玻片，倒去多余的葡聚糖溶液，并将其放回陶瓷架中。用清水多次冲洗盖玻片，然后将其浸泡于水中48小时。可将容器置于旋转摇床上轻轻振荡。
14. 将盖玻片在80°C烘箱中干燥，并保存于真空干燥器中。

脂质体的制备

通过将脂质体吸附到葡聚糖功能化的盖玻片上形成支撑脂双层。吸附的脂质体相互融合，直至膜破裂并在表面铺展成平面。

1. 本实验所用的典型脂质体配方包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）、胆固醇、牛脑二唾液酸神经节苷脂（GD_1a）以及N-((6-(生物素基)氨基)己酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺，各组分比例为4:4:2:0.1:5×10^-5。所有组分均保存于氯仿或氯仿与甲醇的混合溶液中。
2. 取各组分适量，加入玻璃试管中，配制成总脂量为两微摩尔的混合液。在氩气或氮气流下蒸发溶剂，随后将试管置于真空干燥器中两小时，以彻底去除残留溶剂。
3. 用400微升HNE缓冲液（5 mM HEPES、145 mM NaCl、0.1 mM EDTA）重悬干燥的脂膜。
4. 将悬浮液转移至塑料微量离心管中，先在液氮浴中冷冻，再于温水浴中解冻。重复此冻融循环四次。
5. 将带有100 nm聚碳酸酯膜滤器的脂质体挤出器装配好，将脂质悬浮液挤出25次。挤出后，悬浮液应变得更为透明。
6. 脂质体应在制备当日使用，可于室温下保存至使用前。

微流控流动池制备

通过将双面胶带夹在石英载玻片和功能化盖玻片之间，即可制成一种简单的微流控流动池。

1. 取一块 20×20×3 mm 的石英载片，使用金刚石钻头在相对的两侧各钻一个直径为 1 mm 的孔。
2. 从双面胶带上裁剪出一个 20 mm 见方的正方形，然后用剃刀刀片在其中心切出一个 15×2 mm 的矩形区域。
3. 撕去胶带一侧的背衬，将胶带粘附到石英载片上，再将另一侧粘附到经过功能化的盖玻片上。
4. 截取两段长度为 20 cm 的聚乙烯管，并将其插入石英载片上的孔中。
5. 使用 5 分钟环氧树脂胶密封流动池。
6. 待胶水固化后，用缓冲液对流动池和管道进行预润洗。
7. 此时可通过将约 80 微升的脂质体悬浮液吸入通道内，在此阶段形成支撑脂双层膜。

病毒颗粒标记

1. 通常使用H3N2甲型流感病毒（X-31）进行融合实验，但其他流感毒株及其他病毒也已成功应用。
2. 病毒可标记最多两种不同的荧光染料，以检测半融合和孔形成过程。
3. 将磺酰罗丹明B（SRB）溶解于HNE缓冲液中，配制成20 mM的溶液。取20微升染料溶液与10微升病毒悬液混合，在室温下孵育20小时。在此期间，染料将缓慢积累进入病毒颗粒内部。
4. 通过PD-10脱盐柱去除多余的染料。若使用足量的病毒材料，可在柱中观察到有色条带。该条带含有标记的病毒，可在洗脱时收集。
5. 若无可见条带，则收集200微升的洗脱组分，并通过分光光度计在565 nm处测定吸光度，以确定含有标记病毒的组分。病毒总洗脱体积约为0.8 ml。
6. 向已标记SRB的病毒悬液中加入13微升浓度为2 mM的二甲基亚砜（DMF）溶液的十八烷基罗丹明110（Rh110C18），以标记病毒包膜。
7. 将试管固定在实验室旋转仪上搅拌悬液，孵育3小时。
8. 使用PD-10脱盐柱按照前述方法去除过量的Rh110C18，纯化病毒。

显微镜配置

实验在配备高数值孔径油浸物镜的荧光显微镜上进行，该物镜适用于全内反射荧光显微镜。使用氩/氪气体激光器的488 nm和568 nm谱线分别激发Rh110C18和SRB标记的病毒。通过二向色镜将绿色和红色荧光发射光分离，并将两束图像独立聚焦到电子倍增CCD相机的两个不同半区，从而实现对每种标记的同步成像。

进行检测

融合实验的执行涉及在流动池内逐步组装生化组分：平面脂双层的组装、标记病毒颗粒的停靠、表面包被荧光素，以及用低pH缓冲液启动反应（图1A）。

1. 将流动池安装到显微镜载物台上，并将出口管路连接至设定流速为每分钟 40 微升的注射泵。
2. 通过注入 300 微升 HNE 缓冲液，清除流动通道中多余的脂质体。
3. 调节显微镜焦距，并调整激光功率，使样品表面受到 350 W/cm² 的 488 nm 光照和 70 W/cm² 的 568 nm 光照。若使用 1.45 数值孔径的 60 倍油浸物镜，请将激光强度分别设为 100 微瓦和 20 微瓦。
4. 将标记病毒（稀释 1/100）泵入流动池。随着病毒扩散至流动通道底部表面，病毒颗粒将开始黏附于脂双层中掺入的神经节苷脂上。
5. 当病毒颗粒的附着密度达到合适水平（每视野最多约 1000 个颗粒）时，切换进样管路至含有每毫升 2 微克荧光素标记链霉亲和素的溶液。标记的链霉亲和素将结合脂双层中与生物素偶联的脂分子，最终可观察到微弱的绿色背景荧光。
6. 用 300 微升 HNE 缓冲液冲洗流动通道。
7. 选择成像区域，调节显微镜焦距，并准备 CCD 相机进行时间序列图像采集。将曝光时间设为 100 毫秒，以每秒 10 帧的速率采集图像。
8. 通过注入含 10 mM 柠檬酸钠和 140 mM NaCl 的酸性缓冲液启动融合反应。缓冲液的 pH 应调节至低于待测病毒的临界 pH 值。X-31 病毒在 pH 低于 5.5 时发生融合。

代表性结果

图1B展示了双层膜锚定病毒颗粒在融合前和融合过程中的快照。每个衍射极限光斑代表一个单独的病毒颗粒。红色和绿色荧光分别成像到CCD相机的上半部和下半部，从而可以同时观察病毒包膜和内容物标记。通常情况下，绿色通道中的光斑数量约为红色通道的两倍，这反映了内容物染料的标记效率低于包膜标记物。表面结合的荧光素所产生的绿色背景荧光在柠檬酸盐缓冲液到达时消失，由此可确定融合反应的起始时间。半融合事件表现为绿色荧光的突然增强，这是因为病毒包膜中原本被淬灭的Rh110C18通过半融合颈扩散，并在平面膜中被稀释。在发生半融合的颗粒周围可见向外扩展的荧光云状结构，表明脂肪酰基连接的染料在平面膜中自由扩散。融合孔的形成则表现为被包裹在病毒颗粒内部的SRB红色荧光逐渐减弱。融合孔的打开使染料得以释放到平面双层膜下方的水相空间，并离开观察区域。

通过单个颗粒的积分荧光强度绘制出的每个颗粒的荧光强度轨迹，有助于确定半融合和孔形成的发生比例及时间（图1C）。半融合和孔形成事件的时间点被确定为Rh110C18荧光爆发或SRB信号衰减的最大斜率出现的时刻。在成功的实验中，约50%标记有Rh110C18的颗粒产生去猝灭信号，30%标记有SRB的颗粒可提供可用信号。在同时标记两种染料的颗粒中，约10%同时显示出脂质混合和孔形成信号。

图2A-C展示了典型实验中半融合和孔形成滞后时间的分布情况。图2D-F展示了在相同条件下进行的五次实验合并后的事件分布。即使观测次数不多，直方图的形状仍然清晰可辨。由于每次实验均通过检测pH下降时间进行同步，因此可以将多个实验数据合并，从而获得有关速率限制中间步骤的详细信息。

图1. 实验设计。A) 病毒颗粒用两种荧光染料标记，以监测半融合和融合孔形成的动力学过程。荧光信号由高数值孔径（NA）显微镜物镜收集，并成像至CCD上。B) 单个病毒颗粒融合前（左）和融合过程中（右）的荧光图像。每幅图像的上半部分和下半部分分别对应同一约50 × 100 mm² 支持性脂双层区域的红色和绿色荧光。C) 红色SRB病毒内容物示踪剂（上迹线）、绿色Rh110C18膜染料（中迹线）和荧光素pH传感器（下迹线）的荧光强度提供了pH下降、半融合和完全融合之间精确的时间间隔。请点击此处查看图1的放大版本。

图 2. 荧光标记病毒的融合动力学。pH 下降至发生半融合（A，D）以及孔形成（B，E）之间所经历时间的分布。分布曲线的上升和衰减表明存在多个中间步骤。单个颗粒从半融合到融合孔打开的转变呈指数分布，提示存在单一限速步骤。图 A-C 显示单次实验的结果。图 D-F 汇总了在相同条件下进行的五次独立实验的数据。请点击此处查看图 2 的放大版本。

讨论

制备流体和连续支撑脂双层可能具有挑战性。微量的污染物或表面缺陷都会阻碍脂双层的铺展。仔细清洗并沉积一层均匀的葡聚糖至关重要。

长时间成像病毒颗粒可能导致荧光标记发生漂白或失活。此类光损伤在生物成像和单分子研究领域广为人知，通常认为是由激发态荧光分子产生活性氧物种所引起。为尽量减少光损伤，我们通常会降低激发激光功率，并避免在实验开始前进行长时间曝光。采用多种已报道的除氧系统之一将缓冲液中的氧气去除，可能有助于减轻这一问题。

要获取有关瞬态中间态的信息，必须精确同步融合反应。所使用的流速以及进样管路和流动池通道的死体积是可能限制同步性的因素。融合反应通过将中性pH缓冲液置换为酸性pH缓冲液来启动。然而，当酸性缓冲液流经进样管路进入流动池时，两种缓冲液之间的界面会因扩散而混合，并逐渐变得模糊不清。这会在双层膜表面形成pH梯度，导致起始时间的确定变得不清晰。此外，由于融合动力学依赖于质子浓度，实验开始时存在的pH梯度可能会使结果的解释复杂化。在本实验中，融合动力学过程远慢于pH转换时间，因此梯度效应对融合动力学的影响不显著。目前我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
康宁盖玻片，25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
熔融石英载玻片	Technical Glass
染色架	Thomas Scientific	8542E40
(3-环氧丙基)三甲氧基硅烷	Gelest Inc.	SIG5840.1
葡聚糖 T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
胆固醇	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
N-((6-(生物素基)氨基)己酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷脂–乙醇胺，三乙基铵盐 (生物素-X DHPE)	Invitrogen	B1616
链霉亲和素-荧光素偶联物	Invitrogen	S-869
牛脑来源的双唾液酸神经节苷脂 GD1a	Sigma-Aldrich	G2392
微型挤出器	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
0.1 微米聚碳酸酯膜滤器	Whatman, GE Healthcare	800309
10 mm 排水盘（膜支撑物）	Whatman, GE Healthcare	230300
磺基罗丹明B钠盐		S1402
十八烷基罗丹明110 (Rh110C18)			参见 Floyd et al. 2008 年发表的合成方案
PD-10 脱盐柱	GE Healthcare	17-0851-01
尼康荧光显微镜	Nikon Instruments	TE2000-U
Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 物镜	Nikon Instruments
Innova 70C Spectrum Ar/Kr 激光器	Coherent Inc.
注射泵	Harvard Apparatus	702213