Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée)

Summary

Électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée est utilisée pour séparer l'ADN simple brin ou l'ARN jusqu'à une limite de 500 nucléotides. L'urée en combinaison avec des échantillons dénature la chaleur et non structurées brins simples migrer dans la matrice de gel en fonction de leur poids moléculaire.

Abstract

PAGE urée ou électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée emploie 6-8 M d'urée, qui dénature l'ADN secondaire ou structures d'ARN et est utilisé pour leur séparation dans une matrice de gel de polyacrylamide en fonction du poids moléculaire. Fragments de 2 à 500 bases, avec des différences de longueur aussi petite que d'un seul nucléotide, peuvent être séparés en utilisant cette méthode ^1. La migration de l'échantillon est dépendante de la concentration d'acrylamide choisi. Un pourcentage plus élevé de polyacrylamide résout fragments de poids moléculaire plus faible. La combinaison de l'urée et des températures de 45-55 ° C pendant la course de gel permet la séparation de l'ADN non structurées ou des molécules d'ARN.

En général, cette méthode est nécessaire d'analyser ou de purifier l'ADN simple brin ou de fragments d'ARN, comme les oligonucléotides synthétisés ou étiquetés ou produits à partir des réactions de clivage enzymatique.

Dans cet article, vidéo, nous montre comment préparer et exécuter les gels de polyacrylamide dénaturant l'urée. Conseils techniques sont inclus, en plus des ^1,2 protocole original.

Protocol

Le protocole de texte complet et détaillé de cette procédure expérimentale est disponible dans Current Protocols in Molecular Biology. Détaillées étape par étape les instructions pour l'assemblage du sandwich de gel et pour les appareils de gel peut être trouvé sur le site BioRad ^3.

Équipement requis:
Les plaques de verre (intérieur et extérieur)
10 cm de cellules: 10,1 x 7,3 cm (plaque interne), 10,1 x 8,2 cm (plaque extérieure), BioRad
20 cellules cm: 20 x 20 cm (plaque interne), 20 x 22,3 cm (plaque extérieure), BioRad
De 0,5 à 1,5 mm de gel de peigne et entretoises
Se jetant Gel
Gel appareil avec le couvercle et les câbles
Alimentation haute tension
Bloc de chauffage ou l'eau du bain
Pipettes sérologiques et l'aide de pipette
Pipette et pointes de pipette
Sèche-Gel ou un scanner

Réactifs et solutions:
Urée (ultra-pure)
Solution de polyacrylamide 40% (29:1)
10 x TBE solution (Tris-Borate, EDTA)
Déminéralisée, eau distillée
TEMED
30% (p / v) solution de persulfate d'ammonium
0,5 x TBE solution
Formamide
EDTA
Cyanol Xylène
Bleu de bromophénol
Méthanol
Éthanol

Volume	50 ml			60 ml			10 ml
Concentration de l'acrylamide	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g d'urée	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4.8	4.8	4.8
ml à 40% Acryl (29:1)	12,5	15.625	18,75	15	18,75	22,5	2.5	3,125	3,75
APS ul 30%	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Remplissez le volume avec déminéralisée, eau distillée

Tableau 1: Réactifs et solutions nécessaires pour les diverses concentrations d'acrylamide et les volumes pour résoudre seule oligonucléotides bloqués

Assemblage en sandwich de gel et gel préparation

1. Assemblez le gel selon la description des fabricants et de fixer le gel dans la chambre de coulée de gel ^3. Utiliser 0,5-1,5 mm d'épaisseur des entretoises.
2. Préparer la solution de polyacrylamide appropriée, conformément aux protocoles actuels de la biologie moléculaire ou en tant que figurant dans le tableau 1. Pour un gel d'acrylamide dénaturant de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solution de gel et d'une 10,1 x 8,2 cm x 1 mm de gel de 5 ml solution de gel est suffisante. Agrandir les gels sont utilisés lorsque les produits attendus / bandes sont dans la fourchette de quelques bases, puis un gel de plus permettra de résoudre les bandes avec une différence d'un seul nucléotide. Si les bandes attendus diffèrent dans plus de 10 nucléotides, les petits gels seront adaptés pour résoudre les fragments. Choisissez le pourcentage de polyacrylamide qui convient à vos besoins de séparation, une concentration plus élevée de polyacrylamide résoudra bas poids moléculaire des fragments. Utilisez l'urée ultrapure et mélanger avec la quantité désirée de l'acrylamide. Ajouter tampon TBE au mélange de gel pour obtenir une concentration finale de 0,5-1 x TBE et de remplir le volume avec déminéralisée, eau distillée. Chauffer la solution pendant 20 secondes au micro-ondes et mélangez délicatement. Pour les volumes de gel plus répéter cette étape jusqu'à ce que la solution est la main chaude.
3. Verser le gel immédiatement à l'aide d'une pipette sérologique et une aide pipette automatique entre les deux plaques de verre. Évitez d'introduire des bulles d'air. Insérer le peigne et laisser le gel polymériser pendant 30-60 minutes.

Mettre en place l'appareil d'électrophorèse et le gel prerun

1. Démonter le gel de la chambre de coulée et l'assemblage de l'appareil gel selon les instructions du fabricant ^3.
2. Remplir le tampon inférieure chambre tampon d'esprit de fonctionnement (0,5-1 x TBE) que les plaques de verre seront sousfusionnées 2-3 cm avec le tampon. Remplir la chambre tampon supérieure au sommet du gel avec courir tampon.
3. Retirer délicatement le peigne et rincer les puits avec du tampon fonctionne, en utilisant une pipette et un gel des conseils de chargement.
4. Fixez le couvercle du système de gel et de brancher les câbles à une alimentation haute tension. Avant que vous pouvez charger vos échantillons, vous devez prerun le gel pendant au moins 30 minutes pour chauffer le gel et pour éliminer l'urée reste du gel. La température optimale doit être comprise entre 45-55 ° C. Évitez les températures supérieures à 60 ° C comme les bandes pouvaient frottis ou les plaques de verre pourrait se fissurer. Choisissez watts constante pour la prerun (15-25 W par gel).

La préparation des échantillons

1. En attendant de préparer vos échantillons. Par conséquent, ajouter la quantité appropriée de 2 mix x chargement de gel à votre échantillon. Le mélange de chargement contient généralement formamide 90%, 0,5% d'EDTA, 0,1% cyanol xylène et 0,1% bleu de bromophénol.
2. Avant les échantillons peuvent être chargés sur le gel, les échantillons doivent être dénaturée par la chaleur en chauffant les échantillons entre 70-90 ° C pendant quelques minutes.

Charger et exécuter le gel

1. Lorsque le prerun est terminée, retirez le couvercle et rincez soigneusement les poches, comme décrit précédemment que l'urée est lessivé dans les puits.
2. Appliquer les échantillons soigneusement au fond de la poche. Évitez d'introduire des bulles d'air. Chargement du tampon doit être appliquée aux poches vides pour maintenir des conditions d'égalité pendant la course.
3. Assemblez le couvercle et lancez le gel à watts constants pour maintenir une température de gel de 55 ° C similaire à la prerun. Observez la migration des colorants marqueur jusqu'à ce que le front a atteint l'extrémité inférieure du gel. La durée d'exécution dépend du pourcentage d'acrylamide utilisé, la force ionique du tampon et de l'épaisseur du gel. Une course peut durer entre 2-4 heures.
   Vérifiez la température du gel. Un thermomètre de gel peut aider à surveiller la bonne température pendant la course.

Traiter le gel de

1. Lorsque le front de teinture a atteint la fin du gel placer le gel de la chambre inférieure du tampon. Retirer le gel de la chambre et desserrer les pinces. Retirez les entretoises et soigneusement dissimuler les plaques de verre. Si nécessaire couper les puits supérieur contenant une partie du gel.
2. Soigneusement transférer le gel dans un plat avec une solution de fixation du gel (même concentration de méthanol TBE, plus de 5-10% et éthanol). Laisser le gel dans la solution pendant 5-10 minutes et changer le tampon à deux reprises.
3. Le gel est prêt pour un traitement ultérieur en utilisant un séchoir sous vide ou de gel de numérisation directe du gel.

Discussion

1. La netteté bande dépend de plusieurs facteurs. Le volume d'échantillon chargé pour les bandes pointus devrait être aussi petit que possible, c'est à dire idéalement entre 1-5 pl. Toutefois, jusqu'à 15 ul ne peut être chargé qui assure toujours une résolution acceptable. Moins de résultats volume d'échantillon plus nettes bandes.
2. La qualité bande est également dépendant de l'épaisseur du gel. Diluant gels, tels que 0,75 mm montrent de meilleurs résultats que 1,5 mm d'épaisseur des gels.
3. La forme de bandes peuvent également être influencée pendant le chargement de gel, si l'échantillon n'est pas appliquée également dans la poche de gel. Dont 10% de glycérol dans le tampon de chargement permet pendant le chargement de gel et les puits d'échantillon dans le puits plus facilement.
4. Un autre problème potentiel qui est connecté avec le tampon de chargement de l'échantillon peut se produire, si le produit attendu (s) fonctionne au même niveau que l'un des colorants de chargement. De plus, si les étiquettes fluorescentes sont utilisées, certains colorants montrent un signal de fluorescence à une longueur d'onde similaire. Si c'est le cas enlever un colorant ou tous les colorants peuvent résoudre ce problème. Ensuite, il est conseillé de lancer l'échantillon contenant un colorant dans un puits vide comme un standard de taille.
5. Basse tension au début de la course permet aussi d'obtenir des bandes plus nettes, comme l'échantillon entre le front de gel de douceur et évite que l'effondrement de gel en raison de poches de haute tension. Un pourcentage d'acrylamide courte faibles empilage de gel (4%) peuvent avoir la même bande d'affûtage effet.
6. Un problème souvent rencontré est le gel de "sourire", qui est due à la distribution inégale de la chaleur à travers le gel pendant l'électrophorèse. Si le gel n'est pas entouré de tampon, selon lesquelles le système de gel est employé, en joignant une plaque de métal à la plaque de verre supporte une distribution égale de la chaleur et peuvent augmenter considérablement la qualité de gel.
7. Silanisation de plaques de verre pour les grands gels est conseillé, car il améliore grandement la manipulation des gels après la course, comme les gels ont tendance à coller aux plaques de verre.

Électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée (urée-PAGE) est utile pour analyser ou séparer l'ADN simple brin ou de fragments d'ARN ainsi que des échantillons radionucléotide ou marqués par fluorescence.