Summary
Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.
Abstract
De bodem microbioom is een groot en relatief onontgonnen reservoir van genomische diversiteit en metabole innovatie die nauw is verbonden met voedingsstoffen en energie stromen binnen terrestrische ecosystemen. Teelt-onafhankelijke milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, benaderingen beloven een ongekende toegang tot deze genetische informatie met betrekking tot de pad wederopbouw en functionele screening voor hoogwaardige therapeutische en biomassa conversie processen. Echter, de bodem microbioom blijft nog steeds een uitdaging grotendeels te wijten aan de moeilijkheid bij het verkrijgen van een hoog moleculair gewicht DNA van voldoende kwaliteit zijn voor grote insert bibliotheek productie. Hier introduceren we een protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht, microbiële gemeenschap genomisch DNA uit bodems en sedimenten. De kwaliteit van de geïsoleerde genomisch DNA is ideaal voor de aanleg van grote insert milieu genome bibliotheken voor downstream-sequencing en screening toepassingen.
De procedure begint met cel lysis. Celwanden en membranen van micro-organismen worden gelyseerd door zowel mechanische (slijpen) en chemische krachten (β-mercapto-ethanol). Genomisch DNA wordt vervolgens geïsoleerd met behulp extractiebuffer, chloroform-isoamylalcohol en isopropyl alcohol. De buffers gebruikt voor de lysis en de winning stappen omvatten guanidine isothiocyanaat en hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) om de integriteit van het hoge moleculair gewicht genomisch DNA te behouden. Afhankelijk van uw downstream toepassing, kan het geïsoleerde genomisch DNA verder worden gezuiverd met behulp van cesium chloride (CSCL) gradiënt ultracentrifugatie, die verontreinigingen, zoals humuszuren vermindert. De eerste procedure, extractie, duurt ongeveer acht uur, met uitzondering van DNA kwantificering stap. De CsCl gradiënt ultracentrifugatie, is een proces van twee dagen. Gedurende de gehele procedure, genomisch DNA moet voorzichtig behandeld worden om afschuiven te voorkomen, te vermijden ernstige vortexen, en repetitieve hard pipetteren.
Protocol
Deel I: Extractie van DNA
Procedure
1. 8 uur nodig zijn, voor de verwerking van zes monsters met uitzondering van de kwantificering van DNA.
Voordat u begint met de winning, dan moet u vooraf-chill mortier, de stamper en spatel in een -20 ° C vriezer of met behulp van vloeibare stikstof. Ook pre-chill 50 ml buisjes met 20 ml chloroform isoamylalcohol (24:1) op ijs. Zet de hybridisatie oven voor op 65 ° C te verwarmen. Controleer CTAB oplossing, als het warm is gekristalliseerd tot 60 ° C om de kristallen te smelten. Vul de denaturering oplossing en extractie buffer door het toevoegen van de laatste ingrediënten net voordat je de extractie (zie recept hieronder) te starten. Voeren al extractieprocedures in een zuurkast.
2. Bereid de denatureren buffer en extractie buffer.
Opmerking: Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, is het essentieel om precies te maken buffers volgens de instructies.
3. Breng 2 g van de bodem in een pre-gekoelde mortel.
Let op: bodem verzameld in het veld moeten worden bevroren op droog ijs voor transport en opgeslagen bij -80 ° C. Ontdooien en zeef bodem met behulp van een 2 mm zeef voor DNA-extractie. U kunt de basisbedrag van de grond tot 10 g.
4. Voeg 1 ml van de denaturering oplossing voor de bodem.
5. Freeze en maal de bodem in vloeibare N 2 met behulp van een stamper tot aan de bodemdeeltjes kijken poederachtige en homogeen is. Herhaal het invriezen en slijpen tweemaal.
Let op: Houd de grond bevroren monster tijdens het malen, met behulp van vloeibare stikstof genoeg om volledig te dekken het grondmonster. Lichte smelten tijdens het slijpen is aanvaardbaar.
6. Overdracht van de grond grond om een 50 ml conische buis met behulp van een pre-gekoelde spatel.
Opmerking: De begane grond monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C op dit punt, indien nodig.
7. Voeg 9 ml extractie buffer. Aan de oplossing en bodem, vortex kort bij een lage snelheid mix.
Opmerking: Om de buffer homogeen is, is het warm bij 60 ° C gedurende 10-15 minuten vóór gebruik. Houd de rest van de buffer bij 60 ° C gedurende de extractie. Vortex op snelheid 8 (op een schaal waar 10 is het maximum).
8. Incubeer 40 min bij 65 ° C in een hybridisatie oven. Tijdens de incubatie, continu draaien de buizen op de laagste snelheid, of voorzichtig omkeren van de buizen om de 10 minuten.
Let op: horizontaal Plaats de buis in een hybridisatie oven om buffer aan de bodem contact over een groot oppervlak. De oplossing kan er een beetje stroperig tijdens de incubatie.
9. Centrifugeer bij 1800 x g, gedurende 10 minuten bij 10 - 14 ° C. Overdracht supernatans in de pre-gekoelde 50 ml conische buis met 20 ml chloroform-isoamylalcohol (24:1), te houden op ijs.
Opmerking: Als u supernatant transfer, pas dan op dat van de organische laag (onderste laag) verstoren. Laat 1-2 ml supernatant als het nodig is om alleen schone supernatant te verzamelen. Je ziet vaak een beige laag (ongeveer 1-3 mm dik) op de top van het supernatant. Niet storen deze laag bij het ophalen van het supernatant. Probeer de tip glijden langs de buiswand om breuk van deze beige laag te voorkomen. Als het supernatant is te troebel, herhaal dan de chloroform-isoamylalcohol extractie nog een keer op het supernatant. Gebruik geen plastic wegwerp pipetten bij het overbrengen van chloroform, zoals chloroform zal het plastic smelten. Gebruik een glazen pipet, of een glas maatcilinder, of giet chloroform in 50 ml conische buizen.
10. Pak de bodem pellets twee keer;
10,1. Voeg 5 ml extractie buffer om de bodem te pellets, meng met 1 ml tip gevolgd door een korte vortexen bij lage snelheid.
Let op: Schud en meng de buffer voor gebruik.
10,2. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min in hybridisatie oven. Centrifugeer bij 1800 x g, gedurende 10 minuten bij 10 - 14 ° C.
Overdracht supernatant aan de buis bij stap 9. Houd de tube met de verzamelde supernatant en chloroform-isoamylalcohol op het ijs tijdens de extractie.
Opmerking: Zorg ervoor dat u de supernatant toevoegen aan dezelfde buis zonder kruising tussen het mengen van de monsters.
10,3. Herhalen 9.1 en 9.2 nog een keer.
11. Met behulp van een roterende plaat, heel voorzichtig rots de buis die de verzamelde supernatans (14-19 ml) en chloroform-isoamylalcohol op 1,25 rpm gedurende 10 minuten bevat.
Let op: Sluit het deksel zeer strak om lekkage te voorkomen. Leg een papieren handdoek op de rockende plaat voordat u de buis, zodat eventuele lekken gemakkelijk kan worden gedetecteerd.
12. Centrifugeer bij 1800 x g, voor 20 min bij 10 - 14 ° C.
13. Overdracht waterige fase naar een nieuwe buis.
Let op: Niet storen de interfase tussen de waterfase (bovenste laag) en de organische laag (onderlaag) wanneer u de supernatant overdracht. Laat ongeveer 1,5 tot 2 ml supernatant collectie van slechts schone supernatant te verzekeren.
14. Herstel de DNA met behulp van isopropylalcohol (stap 15.a - 21.a). U kunt ook Amicon ® Ultra-15 centrifugaalfilter Devices (stap 15.b - 21.b) als u zeer lage hoeveelheid biomassa in de steekproef, die nauwelijks zichtbaar zijn pellets zal produceren door isopropylalcohol neerslag die moeilijk te herstellen verwachten.
15.a. Plaats de supernatant naar een nieuwe buis ultracentrifuge.
16.a. Voeg isopropylalcohol om de verzamelde supernatant bij een volume verhouding van 0.6:1. Omgekeerde de buizen voorzichtig een paar keer om te mengen.
17.a Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
18.a. Centrifugeer bij 16.000 x g, gedurende 20 min bij 20 - 25 ° C. Zorg ervoor dat de gewichten van alle buizen zijn goed in balans voor de centrifugatie stap.
Let op: Mark de richting van de middelpuntvliedende kracht op de buis, zodat u de DNA-pellet makkelijker te detecteren wanneer de DNA-opbrengst is laag.
19.a. Verwijder isopropyl alcohol door decanteren of vacuüm afzuiging. Wees voorzichtig dat u de DNA pellet te verstoren.
Opmerking: Verwijder isopropylalcohol zo snel centrifugeren is voltooid. Wees heel voorzichtig dat u de DNA pellet te verliezen. De grootte van de DNA-pellet kan sterk variëren, afhankelijk van het bodemtype, van een duidelijk zichtbaar (~ 9 mm diameter) tot nauwelijks zichtbaar. Het wordt aanbevolen om het residu van isopropylalcohol verwijderen door uitzuigen langs de wand van de buis voorzichtig om niet te zuigen uit de DNA-pellet.
20.a. Droog DNA pellet bij kamertemperatuur gedurende 5 - 20 min..
Let op: niet te droog DNA pellet, anders zal het moeilijk zijn om het DNA weer wordt opgelost.
21.a. Resuspendeer de DNA pellet in 200 ui TE. Meng het door zachtjes te tikken. Breng de DNA-oplossing in 1,5 ml buis. Houd de buis bij 4 ° C gedurende de nacht om volledig te ontbinden DNA.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van korrel, kunt u het volume van TE aan te passen aan toe te voegen. Meestal 200 tot 400 ul van TE werkt goed.
* U kunt ook de volgende stappen 15.b - 21.b.
15.b. Pre-wash een Amicon ® Ultra-15 centrifugaalfilter Devices, voeg 15 ml TE aan het apparaat en centrifugeer bij 3500 x g, gedurende 10 minuten. Gooi de flow-through.
16.b. Plaats de DNA-oplossing van stap 13 tot en met de pre-gewassen Amicon filter. Centrifugeer bij 3500 x g totdat het DNA volume is teruggebracht naar 200 - 500 pi. Gooi de flow-through.
17.b. Twee keer was de DNA met TE, voeg 10 ml TE aan de Amicon filter apparaten. Centrifugeer bij 3500 x g totdat het DNA volume is gereduceerd tot ongeveer 200 ul. Gooi de flow-through. Herhaal dit nog een keer.
18.b. Breng de DNA-oplossing op het filter om een nieuwe 1,5 ml buis.
19.b. Voeg 40 ul TE aan de Amicon filter. Was beide zijden van het filter membranen door en neer te pipetteren om eventuele DNA-resten terug op het filter. Voeg deze wassen oplossing voor de buis bij stap 18.b.
20.b. Indien nodig, kan het DNA worden verder geconcentreerd door Microcon ® Ultracel YM-30 centrifugaalfilter Unit; het filter pre-wash door de toevoeging van 200 ul TE en centrifugeren bij 10000 x g voor 7 minuten. Voeg de DNA-oplossing op het filter en centrifugeer bij 5000 x g gedurende 1 minuut. Herhaal het centrifugeren totdat het bedrag van de DNA-oplossing op het filter teruggebracht tot 50 pi ongeveer.
Let op: Maximaal eerste steekproef volume voor Microcon filter is 500 pi. Niet centrifuge bij snelheden meer dan 14000 x g. Niet meer dan centrifuge totdat het membraan droogt volledig. Ervoor te zorgen dat wat vloeistof nog steeds de filter dekt na het centrifugeren. Als u over gecentrifugeerd en het membraan droog is, voeg dan 15 ul TE, schud zachtjes gedurende 30 seconden, en ga verder met stap 21.b.
21.b. Plaats het filter op zijn kop in een nieuw Microcon buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten aan het DNA te herstellen.
22. Kwantificeren DNA door TAE-gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V voor 4 uur), en door Nanodrop spectrofotometer of Pico-groen-test en de plaat lezer.
Let op: DNA bedrag kan worden geschat door het vergelijken van het monster band naar de marker band met een bekende concentratie (High moleculaire DNA-merker of λHindIII) op de gel.
23. Controleer de integriteit van hoog moleculair gewicht DNA met behulp van Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) met 1%, 1xTAE gel (Voor meer details zie de Step II, part2 op http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 door Taupp et al. 2009)..
Opmerking: U kunt regelmatig agarose gel gebruiken voor dit doel, QC, in plaats van laagsmeltende agarose. Kortom, elektroforese condities zijn als volgt: 2-250 kb, 6 volt, de eerste schakeltijd: 5 sec, laatste schakeltijd: 15 sec, lopen 12 uur bij 14 ° C. SYBR Goud kleuring voor een uur aan het DNA te visualiseren op de gel.
24. Als het molecuulgewicht van geëxtraheerde DNA bevredigend zijn, ga dan naar de volgende CsCl gradiënt centrifuge stap. Als alternatief kan DNA worden bewaard bij -20 ° C of -80 ° C voor de CsCl centrifuge.
De mediane grootte van de DNA moeten zijn gelijk aan of meer bedragen dan 36 Kb, als je wilt een grote voegen metagenomic DNA-bibliotheek te bouwen.
Deel II. DNA-zuivering met behulp van cesium chloride gradiënt ultracentrifugatie
Voorbereiding van de centrifuge: 1,5 - 2 uur
Centrifugatie stap: 18 uur
Het verwijderen van ethidiumbromide (EtBr) en het concentreren van DNA na het centrifugeren: 3 uur
Procedure
Voor meer informatie, zie Wright et al.. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352
Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat
Het totale bedrag van genomisch DNA geïsoleerd uit 2 g van de bosbodem organische (O horizon) en minerale horizonten (Ae, AB, en Bt horizon) (bemonsterd uit de Long Term Soil Productiviteit (LTSP) site gelegen aan Skulow meer, BC, Canada en beheerd door BC Ministerie van bossen en Range) varieerde van 10 mg tot 180 mg. De mediane grootte van de geïsoleerde DNA was meestal tussen 40 - 60 kb (Figuur 1). De verhouding van de absorptie bij 260 nm nm/280 was tussen 1,3-1,6 en er was een piek bij 230 nm, die humuszuur besmetting vaak waargenomen in bodemmonsters kunnen wijzen. De CsCl gradiënt centrifugatie drastisch verminderd deze verontreiniging en verhoogde ook de verhouding van 260/280 naar 1,8 tot 1,9 zoals weergegeven in Figuur 2a en 2b.
Figuur 1. PFGE foto's van de geëxtraheerde genomische DNA voor CsCl ultracentrifugatie. lane1: 1 kb marker 100 ng, laan 2: λHind III marker 100 ng, baan 3: λHind III marker 250 ng, laan 4: λHind III marker 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marker 100 ng, baan 6 en 7: genomische DNA geïsoleerd uit de minerale bodem horizon Ae, baan 8 en 9: genomisch DNA geïsoleerd uit de minerale bodem horizon AB op de LTSP site gelegen Skulow meer, BC
Figuur 2. Chromograms van genomisch DNA gedetecteerd door spectrofotometer voor (A) en na CsCl ultracentrifuge (B). Let op de vermindering van de absorptie waarde bij de 230 nm golflengte na CsCl ultracentrifugatie, die verbetering van de genomische DNA kwaliteit aangeeft. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Development Fund, Genome British Columbia en de British Columbia Ministerie van Bossen en Range bedanken voor de ondersteuning van lopende studies van de bosbodem productiviteit. SL werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
