Summary
מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.
Abstract
Microbiome אדמה הוא מאגר עצום נחקרו יחסית של גיוון גנטי וחדשנות מטבולית קשורה באופן הדוק עם מזין ואת זרימת האנרגיה בתוך המערכות האקולוגיות של כדור הארץ. טיפוח עצמאית גנומית סביבתי, המכונה גם metagenomic, גישות מבטיח גישה חסרת תקדים למידע זה גנטי לגבי שחזור מסלול ההקרנה פונקציונלי טיפולית ערך גבוה המרה תהליכים ביומסה. עם זאת, microbiome אדמה עדיין אתגר בעיקר בשל הקושי בהשגת משקל מולקולרי גבוה DNA באיכות מספיק לייצור להכניס ספריה גדולה. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול לחילוץ משקל מולקולרי גבוה, ה-DNA הגנומי של חיידקים הקהילה מקרקעות ו משקעים. איכות של הדנ"א הגנומי מבודד אידיאלי לבניית סביבתי גדול להכניס ספריות גנומית עבור במורד הזרם יישומים רצף ההקרנה.
ההליך מתחיל עם תמוגה התא. קירות התא ממברנות של חיידקים הם lysed על ידי שני כוחות מכניים (שחיקה) וכימיות (β-mercaptoethanol). הדנ"א הגנומי מבודד מכן באמצעות חיץ החילוץ, כלורופורם, isoamyl אלכוהול אלכוהול איזופרופילי. מאגרים מועסק תמוגה ואת הצעדים החילוץ כוללים isothiocyanate guanidine ו ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) כדי לשמור על שלמות ה-DNA גנומי מולקולרי גבוה במשקל. בהתאם ליישום הזרם שלך, ה-DNA הגנומי מבודד יכול להיות מטוהרים נוסף באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation שיפוע, אשר מפחית זיהומים כולל חומצות humic. הליך השאיבה הראשונה, לוקח כ 8 שעות, למעט שלב כימות DNA. Ultracentrifugation שיפוע CsCl, הוא תהליך יומיים. במהלך ההליך כולו, הדנ"א הגנומי יש לנהוג בעדינות כדי למנוע גז, להימנע vortexing חמורים, pipetting קשים חוזרים.
Protocol
אני חלק: הפקת DNA
נוהל
1. 8 שעות נדרשים, לעיבוד 6 דגימות כולל כימות של ה-DNA.
לפני שתתחיל החילוץ, יהיה עליך ועלי מראש צמרמורת מרגמה, ו מרית מקפיא -20 ° C או באמצעות חנקן נוזלי. כמו כן, מראש צמרמורת 50 צינורות מ"ל המכיל 20 מ"ל כלורופורם isoamyl אלכוהול (24:1) על קרח. הגדר את התנור הכלאה עד 65 מעלות צלזיוס מראש לחום. בדוק פתרון CTAB, אם הוא התגבש חמים 60 ° C כדי להמיס את הגבישים. השלם את הפתרון denaturing ו חיץ החילוץ על ידי הוספת מרכיבים האחרון ממש לפני שאתה מתחיל את החילוץ (ראו מתכון בהמשך). התנהגות מיצוי כל ההליכים במנדף קטר.
2. הכן את החיץ denaturing ו חיץ החילוץ.
הערה: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, הוא קריטי כדי לעשות בדיוק מאגרים ההוראות.
3. מקום 2 גרם של אדמה במכתש מראש צונן.
הערה: קרקע שנאספו בשטח צריך להיות קפוא על קרח יבש הובלה המאוחסן ב -80 ° C. להפשיר קרקע מסננת באמצעות מסננת 2 מ"מ לפני מיצוי DNA. אתה יכול להגדיל את כמות המוצא של אדמה עד 10 גרם
4. הוסף 1 מ"ל של denaturing פתרון הקרקע.
5. הקפאת וטוחנים את האדמה N נוזלי 2 באמצעות העלי עד חלקיקי אדמה להסתכל אבקתי ו הומוגנית. חזור מקפיא שחיקה פעמיים.
הערה: שמור את דגימת אדמה קפואים במהלך שחיקה, באמצעות חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות באופן מלא את המדגם אדמה. התכה קלה במהלך שחיקה מקובל.
6. העברת הקרקע קרקע על צינור חרוטי 50 מ"ל בעזרת מרית מראש צונן.
הערה: דגימת קרקע קרקע יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C, בשלב זה, במידת הצורך.
7. הוסף 9 מ"ל של מיצוי המאגר. כדי לערבב את הפתרון ואדמה, בקצרה מערבולת במהירות נמוכה.
הערה: כדי להבטיח למאגר היא הומוגנית, לחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות לפני השימוש. שמור את שאר חוצץ ב 60 ° C בכל החילוץ. וורטקס במהירות 8 (בסולם שבו 10 הוא הציון המקסימלי).
8. דגירה של 40 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. במהלך הדגירה, ברציפות לסובב את שפופרות במהירות הנמוכה ביותר, או בעדינות להפוך את צינורות כל 10 דקות.
הערה: הניחו את הצינור אופקית בתנור הכלאה לאפשר חיץ לפנות קרקע על פני שטח פנים גדול. הפתרון עשוי להיראות קצת צמיג במהלך הדגירה.
9. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C. העברת supernatant לתוך צינור מראש צינן את חרוטי 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל כלורופורם-isoamyl אלכוהול (24:1), לשמור על הקרח.
הערה: כאשר אתה מעביר supernatant, להיזהר לא להפריע את השכבה האורגנית (השכבה התחתונה). השאירו 1-2 מ"ל של supernatant אם זה הכרחי על מנת לאסוף רק supernatant נקי. לעתים קרובות אתה יכול לראות שכבה בצבע בז' (1-3 מ"מ עובי כ) על גבי supernatant. נא לא להפריע שכבה זו בעת לקיחת supernatant. נסו להחליק את קצה הצינור לאורך הקיר כדי למנוע שבירה של שכבה זו בז'. אם supernatant הוא עכור מדי, לחזור על מיצוי כלורופורם-isoamyl אלכוהול עוד פעם אחת על supernatant. אין להשתמש pipettes פלסטיק חד פעמיות בעת העברת כלורופורם, כלורופורם יתמוססו הפלסטיק. השתמש פיפטה כוס, או כוס סיימה גליל, או לשפוך כלורופורם ישירות לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל.
10. חלץ את כדורי אדמה 2 יותר פעמים;
10.1. הוסף 5 מ"ל מיצוי חיץ את כדורי אדמה, לערבב בעדינות בעזרת טיפ 1 מ"ל ואחריו vortexing קצר במהירות נמוכה.
הערה: Shake ומערבבים החיץ לפני השימוש.
10.2. לדגור על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור הכלאה. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C.
העברת supernatant אל הצינור בשלב 9. שמור את הצינור עם אסף supernatant כלורופורם ו-isoamyl אלכוהול על הקרח במהלך החילוץ.
הערה: ודא שאתה מוסיף את supernatant אל הצינור אותו מבלי לחצות ערבוב בין הדגימות.
10.3. חזור על 9.1 ו 9.2 עוד פעם אחת.
11. בעזרת צלחת מסתובבת, בעדינות רבה הסלע שפופרת המכילה את supernatant אסף (14-19 מ"ל) ו-כלורופורם isoamyl אלכוהול בסל"ד 1.25 עבור 10 דקות.
הערה: סגור את המכסה בחוזקה כדי למנוע דליפה. הניחו מגבת נייר על הצלחת נדנדה לפני המקום הצינור ולכן כל ההדלפות ניתן לאתר בקלות.
12. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 10-14 ° C.
13. העברת השלב מימית לצינור חדש.
הערה: אין להפריע את שלבי הביניים בין השלב מימית (השכבה העליונה) לבין שכבת אורגני (התחתוןהשכבה) בעת העברת supernatant. השאר כ 1.5-2 מ"ל supernatant כדי להבטיח אוסף של supernatant רק נקי.
14. לשחזר את ה-DNA באמצעות איזופרופיל אלכוהול (צעד 15.a - 21.a). לחלופין, להשתמש Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי (שלב 15.b - 21.b) אם אתה מצפה כמות נמוכה מאוד של ביומסה במדגם שלך, אשר ייצרו גלולה בקושי נראו על ידי משקעים אלכוהול איזופרופילי שקשה להתאושש.
15.a. מניחים את supernatant כדי ultracentrifuge צינור חדש.
16.a. הוספת אלכוהול איזופרופילי כדי supernatant שנאסף ביחס נפח של 0.6:1. היפוך הצינורות בעדינות כמה פעמים כדי לערבב.
17.a דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
18.a. צנטריפוגה ב 16000 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 20-25 ° C. ודא את המשקולות של כל הצינורות מאוזנים היטב לפני הצעד צנטריפוגה.
הערה: סמן את כיוון הכוח הצנטריפוגלי ברכבת התחתית, כך שאתה יכול לזהות את ה-DNA גלולה ביתר קלות כאשר התשואה DNA הוא נמוך.
19.a. הסר אלכוהול איזופרופילי באמצעות אחסון או שאיבת אבק. היזהר לא להפריע גלולה DNA.
הערה: הסרה של אלכוהול איזופרופילי בהקדם צנטריפוגה הושלמה. תיזהר מאוד לא לאבד את גלולה DNA. גודלו של ה-DNA גלולה יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג הקרקע, מתוך לעין (~ בקוטר 9 מ"מ) כדי לראות בקושי. מומלץ להסיר את שאריות של אלכוהול איזופרופילי על ידי שאיבה לאורך הקיר של הצינור בזהירות כדי לא היניקה את גלולה DNA.
20.a. יבש DNA גלולה בטמפרטורת החדר למשך 5-20 דקות.
הערה: אל על יבש DNA גלולה, אחרת זה יהיה קשה redissolve את ה-DNA.
21.a. Resuspend גלולה דנ"א TE 200 μl. מערבבים אותו על ידי הקשה עדינה. מעבירים את פתרון ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ"ל. שמור את הצינור ב 4 ° C למשך הלילה כדי לפזר באופן מלא DNA.
הערה: בהתאם לגודל של גלולה, אתה יכול להתאים את עוצמת הקול של TE להוסיף. בדרך כלל 200-400 μl של TE עובד היטב.
* לחילופין, בצע את השלבים 15.b - 21.b.
15.b. טרום לשטוף Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי, מוסיפים 15 מ"ל TE למכשיר צנטריפוגות ב 3500 x גרם, במשך 10 דקות. מחק את הזרימה דרך.
16.b. מניחים את פתרון ה-DNA משלב 13 לסנן מראש הדיחה את Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם 200-500 μl. מחק את הזרימה דרך.
17.b. לשטוף את ה-DNA עם TE פעמיים, מוסיפים 10 מ"ל TE להתקנים לסנן Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם μl כ 200. מחק את הזרימה דרך. חזור עוד פעם אחת.
18.b. מעבירים את פתרון ה-DNA על הפילטר לצינור 1.5 חדש מ"ל.
19.b. הוסף 40 μl TE לסנן את Amicon. לשטוף הן בצד של ממברנות סינון לפי pipetting למעלה ולמטה כדי להתאושש שאריות DNA על המסנן. הוסף את הפתרון הזה כדי לשטוף את הצינור ב 18.b. צעד
20.b. אם יש צורך, הדנ"א יכול להיות מרוכז יותר על ידי Microcon יחידת ® Ultracel-30 י"מ מסנן צנטריפוגלי; מראש לשטוף את המסנן על ידי הוספת 200 TE μl ו centrifuging ב 10000 x גרם במשך 7 דקות. מוסיפים את פתרון ה-DNA כדי לסנן את ו צנטריפוגות ב 5000 x g דקות 1. חזור צנטריפוגה עד סכום של פתרון ה-DNA על המסנן מופחת μl 50 בערך.
הערה: המדגם הראשוני מרבי בנפח של Microcon המסנן 500 μl. אל צנטריפוגות במהירויות מעל 14,000 x ז אל על צנטריפוגות עד מתייבש קרום לחלוטין. ודא כי נוזל כלשהו עדיין מכסה את המסנן לאחר צנטריפוגה. אם אתם מעל centrifuged ואת קרום יבש, ולאחר מכן להוסיף 15 TE μl, להתסיס בעדינות למשך 30 שניות, המשך לשלב 21.b.
21.b. הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon צנטריפוגה חדשה ב 1000 XG 3 דקות לשחזר את ה-DNA.
22. לכמת ה-DNA על ידי טה ג'ל (0.8%, 0.5xTAE, 50 V 4 שעות), ועל ידי ספקטרופוטומטר Nanodrop או פיקו ירוק assay והקורא צלחת.
הערה: כמות ה-DNA יכול להיות מוערך על ידי השוואת הלהקה מדגם ללהקה סמן עם ריכוז ידוע (DNA גבוהה סמן מולקולרי או λHindIII) על הג'ל.
23. בדוק את שלמות ה-DNA משקל מולקולרי גבוה באמצעות שדה פעמו ג'ל אלקטרופורזה (PFGE) עם 1%, 1xTAE ג'ל (לפרטים נוספים ראה את שלב II, part2 ב http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 ידי Taupp et al 2009)..
הערה: ניתן להשתמש בג'ל רגיל agarose למטרה זו QC במקום נמוך ההיתוך agarose. בקיצור, תנאי אלקטרופורזה הן כדלקמן: 2-250 קילו, 6 וולט, זמן המעבר הראשונית: 5 שניות, זמן המעבר הסופי: 15 שניות, לרוץ במשך 12 שעות ב 14 ° C. זהב SYBR מכתים במשך שעה אחת כדי להמחיש את הדנ"א על הג'ל.
24. אם המשקל המולקולרי של הדנ"א חילוץ הם משביעי רצון, ולאחר מכן להמשיך את הצעד הבא צנטריפוגות CsCl הדרגתי. לחילופין, ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C או -80 ° C לפני בצנטריפוגה CsCl.
הגודל הממוצע של ה-DNA צריכה להיות שווה או עולה על 36 KB, אם אתה רוצה לבנות להכניס גדול metagenomic ספריית ה-DNA.
חלק II. ה-DNA טיהור באמצעות ultracentrifugation צזיום כלוריד שיפוע
הכנת צנטריפוגה: 1.5 - 2 שעות
צעד צנטריפוגה: 18 שעות
הסרת ethidium ברומיד (EtBr) לבין ריכוז ה-DNA לאחר צנטריפוגה: 3 שעות
נוהל
לפרטים, עיין רייט et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352
תוצאות נציג / תוצאה
הסכום הכולל של הדנ"א הגנומי מבודד 2 גרם של יער אדמה אורגני (אופק O) אופקים מינרלים (AE, AB, ו Bt אופקים) (שנדגמו פוריות הקרקע ארוך טווח (LTSP) באתר הממוקם Skulow האגם, BC, קנדה ומנוהל על ידי משרד לפנה"ס יערות טווח) נע בין 10 מ"ג עד 180 מ"ג. הגודל הממוצע של ה-DNA בודד היה בדרך כלל בין 40-60 kb (איור 1). יחס ספיגת ב 260 ננומטר nm/280 היה בין 1.3-1.6 והיתה לשיא 230 ננומטר, אשר עשוי להצביע על זיהום חומצה humic נצפה לעיתים קרובות דגימות קרקע. צנטריפוגה שיפוע CsCl מופחת באופן דרסטי את זיהום גם הגדילה את יחס של 260/280 ל 1.8-1.9 כפי שמוצג באיור 2a ו 2b.
1. איור PFGE תמונות של ה-DNA הגנומי חילוץ לפני ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 2: λHind III סמן 100 ננוגרם, מסלול 3: λHind III סמן 250 ננוגרם, מסלול 4: λHind III סמן 500 ננוגרם, lane5: Fosmid 36 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 6 ו -7: גנומית ה-DNA שבודד את האדמה מינרלים האופק AE, מסלול 8 ו -9: הדנ"א הגנומי מבודדים מן א.ב. אדמה מינרלים האופק באתר LTSP ממוקם Skulow האגם, BC
איור 2. Chromograms של הדנ"א הגנומי זוהה על ידי ספקטרופוטומטר לפני (א) ואחרי ultracentrifugation CsCl (B). שימו לב ירידת הערך ספיגת באורך גל 230 ננומטר לאחר ultracentrifugation CsCl, דבר שמצביע על שיפור באיכות הדנ"א הגנומי. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, קולומביה הבריטית ידע ופיתוח הקרן, הגנום קולומביה הבריטית ואת קולומביה הבריטית משרד יערות טווח לתמיכה במחקרים מתמשך של פוריות הקרקע ביער. SL נתמך על ידי מענק ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
