La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Summary

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

Abstract

El microbioma del suelo es un reservorio inmenso y relativamente inexplorado de la diversidad genómica y la innovación metabólica que está íntimamente asociado a los nutrientes y el flujo de energía dentro de los ecosistemas terrestres. Cultivo independiente de genómica ambiental, también se conoce como metagenómica, enfoques promesa de un acceso sin precedentes a esta información genética con respecto a la reconstrucción de la vía y el cribado funcional de alto valor terapéutico y los procesos de conversión de biomasa. Sin embargo, el microbioma de la tierra sigue siendo un reto en gran parte debido a la dificultad en la obtención de ADN de alto peso molecular de una calidad suficiente para la producción de grandes bibliotecas de inserción. Aquí presentamos un protocolo para la extracción de alto peso molecular, el ADN genómico de la comunidad microbiana de los suelos y sedimentos. La calidad del ADN genómico aislado es ideal para la construcción de grandes bibliotecas de insertar genómica ambiental para las aplicaciones posteriores de secuenciación y detección.

El procedimiento se inicia con la lisis celular. Paredes y membranas celulares de los microorganismos se lisan por fuerzas mecánicas (trituración) y químicos (β-mercaptoetanol). ADN genómico se aísla con tampón de extracción, el alcohol cloroformo-isoamílico y alcohol isopropílico. Los tampones utilizados para la lisis y etapas de extracción incluyen isotiocianato de guanidina y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para preservar la integridad de la alta molecular del ADN genómico de peso. Dependiendo de su aplicación posterior, el ADN genómico aislado puede ser purificado con cloruro de cesio (CsCl) ultracentrifugación gradiente, lo que reduce las impurezas tales como los ácidos húmicos. El primer procedimiento, la extracción, dura aproximadamente 8 horas, sin incluir la cuantificación de ADN paso. El gradiente de CsCl ultracentrifugación, es un proceso de dos días. Durante todo el procedimiento, el ADN genómico debe ser tratada con cuidado para evitar la esquila, evitar la agitación grave y dura pipeteo repetitivo.

Protocol

Parte I: La extracción de ADN

Procedimiento

1. 8 horas son necesarias, para el procesamiento de seis muestras de exclusión de la cuantificación de ADN.

Antes de iniciar la extracción, tendrá que pre-chill mortero, mano de mortero y una espátula en un congelador a -20 ° C o el uso de nitrógeno líquido. Además, pre-frío tubos de 50 ml que contiene 20 ml de cloroformo alcohol isoamílico (24:1) en el hielo. Ajuste el horno de hibridación a 65 ° C para precalentar. Compruebe solución CTAB, si se cristaliza caliente a 60 ° C para fundir los cristales. Completar la solución de desnaturalización y tampón de extracción mediante la adición de los últimos ingredientes justo antes de iniciar la extracción (ver receta a continuación). Llevar a cabo todos los procedimientos de extracción en una campana extractora.

2. Prepare el tampón de desnaturalización y tampón de extracción.
Nota: Para maximizar el rendimiento de ADN, es fundamental para hacer precisamente buffers siguiendo las instrucciones.

3. Poner 2 g de suelo en un mortero previamente enfriado.
Nota: Suelo recolectado en el campo debe ser congelado en hielo seco para el transporte y se almacenan a -80 ° C. Deshielo y el suelo tamizado con un tamiz de 2 mm antes de la extracción de ADN. Puede aumentar el importe de partida de suelo de hasta 10 g.

4. Añadir 1 ml de solución de desnaturalización de la tierra.

5. Congelar y triturar el suelo en N ₂ líquido utilizando un mortero hasta que las partículas del suelo mirar en polvo y homogénea. Repetir dos veces por congelación y la trituración.
Nota: Mantenga la muestra de suelo helado durante la molienda, utilizando nitrógeno líquido suficiente para cubrir la totalidad de la muestra de suelo. Fusión leve durante la molienda es aceptable.

6. Transferir el suelo de tierra a un tubo cónico de 50 ml con una espátula de pre-enfriado.
Nota: La muestra de suelo de tierra pueden ser almacenadas a -80 ° C en este punto, si es necesario.

7. Añadir 9 ml de tampón de extracción. Para mezclar la solución y el suelo, agitar brevemente a baja velocidad.
Nota: Para garantizar el buffer es homogénea, que se caliente a 60 ° C durante 10-15 minutos antes de su uso. Mantenga el resto de amortiguamiento a 60 ° C a lo largo de la extracción. Vortex a velocidad 8 (en una escala donde 10 es el máximo).

8. Incubar durante 40 min a 65 ° C en un horno de hibridación. Durante la incubación, girar continuamente los tubos a la velocidad más baja, o invierta suavemente los tubos cada 10 min.
Nota: Coloque el tubo en horizontal en un horno de hibridación para permitir buffer ponerse en contacto con el suelo sobre una superficie más grande. La solución puede parecer un poco viscosa durante la incubación.

9. Centrifugar a 1800 x g, durante 10 minutos a 10-14 ° C. Transferir el sobrenadante en el pre-enfriado tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), mantener en hielo.
Nota: Cuando se transfiere el sobrenadante, tenga cuidado de no alterar la capa orgánica (capa inferior). Agregar 1-2 ml de sobrenadante, si es necesario con el fin de recoger sólo sobrenadante limpio. A menudo se puede ver una capa de color beige (aproximadamente 1-3 mm de espesor) en la parte superior del sobrenadante. No moleste a esta capa al recoger el sobrenadante. Pruebe a deslizar la punta a lo largo de la pared del tubo para evitar la rotura de esta capa de color beige. Si el sobrenadante es demasiado turbia, repetir la extracción de alcohol de cloroformo-isoamílico una vez más en el sobrenadante. No utilizar pipetas desechables de plástico para transferir el cloroformo, el cloroformo se derrita el plástico. Use una pipeta de vidrio, o un vaso cilindro graduado, o verter cloroformo directamente en tubos de 50 ml cónicos.

10. Extracto de las pastillas de suelo 2 veces más;

10.1. Añadir 5 ml de tampón de extracción de los sedimentos del suelo, mezcle suavemente con una punta ml seguido de agitación breve a baja velocidad.
Nota: Agitar y mezclar el búfer antes de su uso.

10.2. Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos en horno de hibridación. Centrifugar a 1800 x g, durante 10 minutos a 10-14 ° C.
Transferir el sobrenadante en el tubo en el paso 9. Mantener el tubo con sobrenadante recogido y el alcohol cloroformo-isoamílico en hielo durante la extracción.
Nota: Asegúrese de agregar el sobrenadante al mismo tubo, sin cruzar la mezcla entre las muestras.

10.3. Repetir 9.1 y 9.2 una vez más.

11. El uso de un plato giratorio, con mucha suavidad oscilar el tubo que contiene el sobrenadante recogido (14-19 ml) y cloroformo-alcohol isoamílico a 1,25 rpm durante 10 minutos.
Nota: Cierre la tapa muy bien para evitar fugas. Coloque una toalla de papel en la placa oscilante antes de colocar el tubo de manera alguna fuga se puede detectar fácilmente.

12. Centrifugar a 1800 x g, durante 20 minutos a 10-14 ° C.

13. Transferencia de fase acuosa a un tubo nuevo.
Nota: No molestar, la interfase entre la fase acuosa (capa superior) y organizacionesnic (capa inferior) cuando se transfiera el sobrenadante. Deje aproximadamente 1,5-2 ml de sobrenadante para garantizar la recogida de sólo sobrenadante limpio.

14. Recuperar el ADN con alcohol isopropílico (paso 15.a - 21.a). Por otra parte, el uso Amicon ® Ultra-15 dispositivos centrífugos de filtro (paso 15.b - 21.b) si espera muy baja cantidad de biomasa en la muestra, que se produce apenas visible precipitado por precipitación alcohol isopropílico que es difícil de recuperar.

15.a. Coloque el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga nuevo.

16.a. Agregar el alcohol isopropílico al sobrenadante recogido en una proporción de volumen de 0,6:1. Invertir los tubos suavemente varias veces para mezclar.

17.a incuba durante 30 min a temperatura ambiente.

18.a. Centrifugar a 16.000 x g, durante 20 minutos a 20 - 25 ° C. Asegúrese de que los pesos de todos los tubos están bien equilibradas antes de la centrifugación.
Nota: Marque la dirección de la fuerza centrífuga en el tubo, para que pueda detectar el pellet de ADN con mayor facilidad cuando el rendimiento de ADN es baja.

19.A. Eliminar el alcohol isopropílico por decantación o la aspiración al vacío. Tenga cuidado de no alterar el pellet de ADN.
Nota: Eliminar el alcohol isopropílico, tan pronto como la centrifugación se ha completado. Tenga mucho cuidado de no perder el pellet de ADN. El tamaño del pellet de ADN puede variar ampliamente dependiendo del tipo de suelo, de muy visible (~ 9 mm de diámetro) que apenas se ve. Se recomienda para eliminar los residuos de alcohol isopropílico por la aspiración a lo largo de la pared del tubo que no cuidado para que al succionar el pellet de ADN.

20.A. Seco en pelets de ADN a temperatura ambiente durante 5 - 20 min.
Nota: No más seco en pelets de ADN, de lo contrario será difícil de disolver el ADN.

21.A. Resuspender el pellet de ADN en 200 l de TE. Se mezcla con unos golpecitos suaves. La transferencia de la solución de ADN en un tubo de 1,5 ml. Mantener el tubo a 4 ° C durante la noche con el fin de disolver completamente el ADN.
Nota: Dependiendo del tamaño del pellet, es posible ajustar el volumen de TE que añadir. Por lo general, 200 a 400 l de TE funciona bien.

* Como alternativa, siga los pasos 15.b - 21.b.

15.b. Prelavado un Amicon ® Ultra-15 dispositivos de filtro centrífugo, agregar 15 ml de TE en el dispositivo y se centrifuga a 3500 x g, durante 10 minutos. Deseche el flujo continuo.

16.b. Coloque la solución de ADN a partir del paso 13 al filtro Amicon pre-lavado. Centrifugar a 3500 x g hasta que el volumen del ADN se reduce a 200 a 500 l. Deseche el flujo continuo.

17.B. Lavar el ADN con el doble de TE, agregar 10 ml de TE a los dispositivos de Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g hasta que el volumen del ADN se reduce a aproximadamente 200 l. Deseche el flujo continuo. Repetir una vez más.

18.b. La transferencia de la solución de ADN en el filtro a un tubo de 1,5 ml nuevo.

19.b. Añadir 40 ml TE al filtro Amicon. Lave ambos lados de la membrana de filtro pipeteando arriba y abajo con el fin de recuperar los residuos de ADN en el filtro. Añadir esta solución de lavado en el tubo de paso 18.b.

20.b. Si es necesario, el ADN puede ser más concentrado por Microcon ® Ultracel YM-30 Unidad de filtro centrífugo, pre-lavado del filtro mediante la adición de 200 l de TE y centrifugar a 10.000 x g durante 7 minutos. Añadir la solución de ADN al filtro y centrifugar a 5000 x g durante 1 min. Repetir la centrifugación hasta que la cantidad de solución de ADN en el filtro reduce a 50 l aproximadamente.
Nota: El volumen máximo inicial de la muestra para Microcon filtro es de 500 l. No centrifugar a velocidades de más de 14.000 x g. No más de centrífuga hasta que se seque completamente la membrana. Asegúrese de que algo de líquido todavía cubre el filtro después de la centrifugación. Si más de centrifugado y la membrana se seca, a continuación, añadir 15 l TE, se agita suavemente durante 30 segundos, y continúe con el paso 21.b.

21.b. Coloque la unidad del filtro boca abajo en un tubo de Microcon nuevas y centrifugar a 1000 xg durante 3 minutos para recuperar el ADN.

22. Cuantificar el ADN de gel de TAE (0,8%, 0.5xTAE, 50 V de 4 horas), y por espectrofotómetro Nanodrop o Pico-verde de ensayo y lector de placas.
Nota: la cantidad de ADN se puede estimar mediante la comparación de la banda de la muestra a la banda con marcador de concentración conocida (marcadores moleculares de ADN de alta o λHindIII) en el gel.

23. Compruebe la integridad del ADN de alto peso molecular mediante electroforesis en campo pulsado (PFGE) con un 1%, 1xTAE gel (Para más detalles vea el Paso II, part2 en http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009)..
Nota: Se puede utilizar gel de agarosa normal para este propósito de control de calidad en lugar de agarosa de baja fusión. En electropho breve,las condiciones de resistencia son los siguientes: 2-250 kb, 6 voltios, el tiempo inicial de conexión: 5 segundos, tiempo final de conmutación: 15 segundos, una duración de 12 horas a 14 ° C. SYBR Gold mancha durante una hora para visualizar el ADN en el gel.

24. Si los pesos moleculares de ADN extraído son satisfactorios, a continuación, proceder a la siguiente etapa CsCl centrifugación de gradiente. Por otra parte, el ADN puede ser almacenado a -20 ° C o -80 º C antes de la centrífuga CsCl.
El tamaño medio del ADN debe ser igual o superior a 36 Kb, si usted quiere construir una gran inserción de la biblioteca metagenómica ADN.

Parte II. De purificación de ADN usando ultracentrifugación gradiente de cloruro de cesio

Preparación de la centrífuga: 1,5 - 2 horas
Centrifugación: 18 horas
La eliminación de bromuro de etidio (EtBr) y la concentración de ADN después de la centrifugación: 3 horas

Procedimiento

Para más información, consulte Wright et al. . 2.009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352

Resultados representante / Resultados

La cantidad total de ADN genómico aislado de 2 g de bosque orgánica del suelo (O horizonte) y horizontes minerales (AE, AB, y los horizontes Bt) (la muestra de la productividad del suelo a largo plazo (LTSP) sitio ubicado en Skulow lago, BC, Canadá y gestionados por BC Ministerio de Bosques y rango) fue de 10 mg a 180 mg. El tamaño medio de ADN fue aislado por lo general entre 40 a 60 kb (Figura 1). La relación de absorbancia a 260 nm/280 nm entre 1.3 a 1.6 y se produjo un pico de 230 nm, lo que puede indicar contaminación de ácidos húmicos observa con frecuencia en las muestras de suelo. La centrifugación en gradiente de CsCl reduce drásticamente la contaminación y también aumentó la proporción de 260/280 a 1,8 a 1,9 como se muestra en la Figura 2a y 2b.

Figura 1. PFGE imágenes del ADN genómico extraído antes de ultracentrifugación CsCl. lane1: 1 kb marcador de 100 ng, carril 2: λHind III marcador de 100 ng, carril 3: λHind III marcador de 250 ng, carril 4: λHind III marcador de 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador de 100 ng, calle 6 y 7: genómica ADN aislado de las Ae horizonte mineral del suelo, carril 8 y 9: ADN genómico aislado de la AB horizonte mineral del suelo en el sitio LTSP encuentra Skulow lago, BC

Chromograms la figura 2. De ADN genómico detectado por espectrofotometría antes (A) y después de la ultracentrifugación CsCl (B). Tenga en cuenta la reducción en el valor de absorbancia a la longitud de onda 230 nm después de la ultracentrifugación CsCl, lo que indica una mejora en la calidad del ADN genómico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.