Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Summary

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Abstract

Toprak mikrobiyomları, karasal ekosistemler içinde besin ve enerji akışı ile yakından ilişkili genomik çeşitlilik ve metabolik yenilik ve nispeten keşfedilmemiş geniş bir rezervuar. Metagenomic olarak da bilinen Yetiştiriciliği bağımsız çevre genomik yaklaşımlar, bu genetik bilginin değeri yüksek tedavi ve biyokütle dönüşüm süreçleri için yolağı yeniden yapılanma ve fonksiyonel taraması ile ilgili benzeri görülmemiş bir erişim söz veriyorum. Ancak, toprak mikrobiyomları, hala büyük ekleme kütüphane üretimi için yeterli kalitede yüksek molekül ağırlıklı DNA temininde zorluk büyük ölçüde bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada toprak ve tortular yüksek molekül ağırlıklı, mikrobiyal topluluk genomik DNA ayıklamak için bir protokol tanıtmak. Izole genomik DNA kalitesi downstream sıralama ve tarama uygulamaları için büyük ekleme çevre genomik kütüphaneler oluşturmak için idealdir.

Bu prosedür, hücre parçalama ile başlar. Mikropların hücre duvarlarını ve membranlar (β-mercaptoethanol) hem mekanik (taşlama) ve kimyasal güçleri tarafından parçalanmış. Genomik DNA ekstraksiyon tamponu, kloroform-izoamil alkol ve izopropil alkol kullanarak izole edilmiştir. Parçalama ve çıkarma adımları istihdam tamponlar guanidin izotiyosiyanat ve yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA bütünlüğünü korumak için hekzadesiltrimetilamonyum bromür (STAB) içerir. Alt uygulanmasına ilişkin olarak, izole genomik DNA sezyum klorür (CSCL) hümik asitler de dahil olmak üzere kirleri azaltır degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak saflaştırılmış olabilir. Ilk yordamı, ekstraksiyon, DNA sayısallaması adım hariç, yaklaşık 8 saat sürer. CSCL degrade Ultrasantrifügasyon, iki gün bir süreçtir. Bütün bu prosedür sırasında, genomik DNA kesme önlemek için nazikçe tedavi edilmelidir, ciddi vorteks önlemek ve tekrarlayan ağır pipetleme.

Protocol

Bölüm I: DNA çıkarımı

Prosedür

1. 8 saat 6 örnekleri DNA ölçümü hariç işlenmesi için gereklidir.

Çıkarma başlamadan önce, ön-chill harç, havaneli ve -20 ° C derin dondurucu içinde spatula veya sıvı azot kullanılarak gerekecektir. Ayrıca, 20 ml kloroform izoamil alkol (24:1) buz üzerinde içeren ön-chill 50 ml tüpler. 65 hibridizasyon fırın ayarlayın ° C ön ısıtma için. ° C kristalleri eritmek için 60 sıcak kristalize ise, CTAB çözüm kontrol edin. Denatüre çözüm ve çıkarma tampon çıkarımı (tarifi aşağıda görebilirsiniz) başlamadan hemen önce son maddeler ekleyerek tamamlayın. Davlumbaz bütün çıkarma işlemleri yürütmek.

2. Denatüre tampon ve tampon ekstraksiyon hazırlayın.
Not: DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için, kesin talimatları izleyerek tamponlar yapmak için kritik önem taşımaktadır.

3. 2 g toprak önceden soğutulmuş harç yerleştirin.
Not: Toprak alanında toplanan taşımacılığı için kuru buz dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanan olmalıdır Çözülme ve DNA ekstraksiyonu öncesinde 2 mm elek elek toprak. 10 g. kadar toprak miktarını artırabilir

4. Toprak çözüm denatüre 1 ml ekleyin.

5. Dondurma ve toprak parçacıkları toz ve homojen bir görünüm kadar bir havaneli _kullanarak 2 sıvı N toprak öğütmek . Dondurma ve taşlama iki kez tekrarlayın.
Not: sırasında donmuş toprak numunesi tutun, taşlama toprak örneği tam olarak karşılamak için yeterli sıvı azot kullanarak. Taşlama sırasında hafif bir erime kabul edilir.

6. 50 ml konik tüp önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak bir zemin toprak aktarın.
Not: zemin toprak örneği bu noktada -80 ° C, gerekirse saklanabilir.

7. Ekstraksiyon tamponu 9 ml ekleyin. Çözüm ve toprak, vorteks kısa bir süre düşük hızda karıştırın.
Not: tampon homojen olduğundan emin olmak için, 60 yaşında sıcak ° C Kullanmadan önce 10-15 dakika. Ekstraksiyon tampon geri kalanı boyunca 60 ° C'de tutun. Vorteks hızı 8 (10 en fazla bir ölçekte).

8. Hibridizasyon fırında 65 ° C'de 40 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, sürekli düşük hızda tüpler döndürmek, ya da hafifçe tüpleri her 10 dakikada bir ters.
Not: tampon büyük bir yüzey alanı üzerine toprak temas etmesine izin hibridizasyon fırında tüp yatay yerleştirin. Çözüm inkübasyon sırasında biraz ağdalı görünebilir.

9 - 14 ° C - 10 10 dakika için 1800 x g santrifüjleyin 20 ml kloroform-izoamil alkol (24:1) içeren önceden soğutulmuş 50 ml konik tüp içine supernatant Transferi, buz üzerinde tutun.
Not: supernatant aktarırken, organik katmanı (alt tabaka) rahatsız etmemek için dikkatli olun. Sadece temiz süpernatant toplamak için gerekli ise 1-2 ml süpernatant bırakın. Sık sık bej süpernatantı üstünde bir tabaka (kalınlığı yaklaşık 1-3 mm) görebilirsiniz. Süpernatantı toplarken bu katman Rahatsız etmeyin. Bu bej tabakasının kırılması önlemek için tüp duvar boyunca ucu slayt deneyin. Süpernatantı çok bulanık ise, süpernatantı kloroform izoamil alkol çıkarma, bir kez daha tekrarlayın. Kloroform aktarırken kloroform plastik eriyecek gibi, tek kullanımlık plastik pipetler etmeyin. Bir cam pipet kullanın veya cam bir silindir mezun, ya da 50 ml konik tüpler içine doğrudan kloroform dökün.

10 Toprak pelet 2 kez daha ayıkla;

10.1. 5 ml ekstraksiyon tamponu toprak pelet ekleyin, hafifçe, düşük hızda kısa karıştırın 1 ml ucu ile karıştırın.
Not: Shake ve tampon kullanmadan önce karıştırın.

10.2. 65 ° C hibridizasyon fırında 10 dakika boyunca inkübe. 14 ° C - 10 10 dakika için 1800 x g santrifüjleyin
Adım 9 tüp supernatant aktarın. Tüp toplanan süpernatant ve kloroform-izoamil alkol ile ekstraksiyon sırasında buz üzerinde tutun.
Not: süpernatantı örnekleri arasında çapraz karıştırma olmadan aynı tüp eklemek emin olun.

10.3. 9.1 ve 9.2 bir kez daha tekrarlayın.

11. Dönen bir plaka kullanarak, toplanan supernatant (14-19 ml) ve 10 dakika için 1,25 rpm'de kloroform-izoamil alkol içeren tüp çok hafifçe sallayın.
Not: kaçağını önlemek için çok sıkı kapağını kapatın. Herhangi bir sızıntı kolaylıkla tespit edilebilir böylece tüp yerleştirmeden önce sallanan plaka üzerinde bir kağıt havlu yatıyordu.

12. 14 ° C - 10, 20 dakika boyunca 1800 x g santrifüjleyin

13. Sulu faz yeni bir tüpe aktarın.
Not: sulu faz (üst katman) ve organik katmanı (alt arasında interfaz Rahatsız etmeyintabakası) süpernatant aktarmak. Sadece temiz süpernatant tahsilini sağlamak için yaklaşık 1.5-2 ml supernatant bırakın.

14. Izopropil alkol (21.a adım 15.a) kullanarak DNA kurtarın. Alternatif olarak, Amicon ® Ultra-15 Santrifüj Filtre Aygıtları (adım 15.b 21.b) kurtarmak için zor izopropil alkol yağış zor görünür pelet üretmek örnek biyokütle çok düşük bir miktar bekliyoruz.

15.a. Yeni bir tüp ultrasantrifüjdeki süpernatantı yerleştirin.

16.a. 0.6:1 bir hacim oranı toplanan süpernatant izopropil alkol ekleyin. Tüpler haricindekileri hafifçe bir kaç kez karıştırın.

17.a oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Madde 18.A. ' 25 ° C - 20 dk 20 16000 x g santrifüjleyin Tüm tüplerin ağırlıkları santrifüj adım önce iyi dengelenmiş olduğundan emin olun.
Not: Mark tüp merkezkaç kuvveti yönü, bu nedenle DNA verimi düşük olduğunda daha kolay DNA pelet algılayabilir.

19.A. Şişeden veya vakum aspirasyon izopropil alkol çıkarın. DNA pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
Not: en kısa sürede santrifüj tamamlanır tamamlanmaz izopropil alkol çıkarın. DNA pelet kaybetmemek için çok dikkatli olun. DNA pelet boyutu zor görünür, açık bir şekilde görünür (~ 9 mm çapında), toprak tipine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. DNA pelet dışarı emme dikkatle tüp duvar boyunca aspirasyon izopropil alkol artıklarını kaldırmak için tavsiye edilir.

Madde 20.A. ' 5 oda sıcaklığında kuru DNA pelet - 20 dk.
Not: kuru DNA pelet üzerine etmeyin, aksi takdirde DNA çözülür için zor olacak.

21.a. 200 ul TE DNA pelletini tekrar. Hafifçe dokunarak karıştırın. DNA solüsyonu 1.5 ml tüp içine aktarın. 4 tüp tutun ° C DNA tamamen çözünmesi için geceleme.
Not: pelet boyutuna bağlı olarak, TE eklemek için ses düzeyini ayarlayabilirsiniz. Genellikle 200 - 400 ul TE iyi çalışır.

* Alternatif adımları 15.b takip 21.b.

15.B. Amicon ® Ultra-15 Santrifüj Filtre Cihazları Ön yıkama 10 dk, 3500 x g santrifüj cihazı ve 15 ml TE ekleyin. Flow-through atın.

16.B. DNA çözümü adım 13 ila önceden yıkanmış Amicon filtre yerleştirin. DNA hacmi 200 azalır kadar 3500 x g'de santrifüjleyin - 500 ul. Flow-through atın.

17.B. TE ile DNA iki kez yıkayın; 10 ml TE Amicon filtre cihazları ekleyin. DNA hacmi yaklaşık 200 ul azalır kadar 3500 x g'de santrifüjleyin. Flow-through atın. Bir kez daha tekrarlayın.

18.B. DNA çözümü için filtre üzerinde yeni bir 1.5 ml tüp aktarın.

19.B. 40 ul TE Amicon filtre ekleyin. Filtre üzerinde herhangi bir DNA kalıntı kurtarmak için yukarı ve aşağı pipetleme filtre membranlar iki tarafında yıkayın. Adım 18.B. tüp yıkama solüsyonu

20.B. Gerekirse DNA Microcon ® Ultracel YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi ile daha da yoğun olabilir; 7 dakika 10.000 x g 200 ul TE ve santrifüj ekleyerek filtre ön yıkama. 1 dakika için 5000 x g filtre ve santrifüj DNA çözüm ekleyin. DNA çözüm filtre miktarı yaklaşık 50 ul düşürüldü kadar santrifüj tekrarlayın.
Not: Maksimum Microcon filtre için ilk örnek hacmi 500 ul. 14000 x g. üzerindeki hızlarda santrifüj etmeyin Membran tamamen kuruyana kadar santrifüj bitmedi. Bazı sıvı filtre santrifüj sonra hala kapladığından emin olunuz. Üzerinde santrifüj ve membran kuru ise, daha sonra, 15 ul TE eklemek 30 saniye hafifçe ajitasyon ve 21.b. adıma geçin

21.b. DNA kurtarmak için 3 dakika xg 1000 yeni bir Microcon tüp ve santrifüj filtre ünitesi başaşağı yerleştirin.

22. TAE jel DNA (% 0.8, 0.5xTAE, 4 saat 50 V) ile sayısal olarak ve Nanodrop spektrofotometre veya Pico-yeşil tahlil ve plaka okuyucu.
Not: DNA miktar jel üzerinde bilinen konsantrasyon (Yüksek moleküler DNA marker veya λHindIII) marker bant için örnek bant karşılaştırarak tahmin edilebilir.

23. (Daha fazla bilgi için Adım II, part2% 1, 1xTAE jel Pulsed Field Jel Elektroforezi (PFGE) kullanarak yüksek molekül ağırlıklı DNA bütünlüğünü denetleyin http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , DOI: Taupp ark 10.3791/1387 2009).
Not: yerine düşük erime agaroz bu QC amaçla düzenli agaroz jel kullanabilirsiniz. Kısaca, elektroforez koşulları aşağıdaki gibi: 2-250 kb, 6 volt, ilk geçiş süresi: 5 sn, son bir geçiş süresi: 15 sn, 14 yaşında 12 saat çalıştırılan ° C SYBR Altın jel üzerinde DNA görselleştirmek için bir saat boyama.

24. Çıkarılan DNA molekül ağırlıkları tatmin edici, daha sonra aşağıdaki CSCL degrade santrifüj adıma geçin. Alternatif olarak, DNA -20 ° C veya -80 saklanabilir ° C CSCL santrifüj önce.
DNA medyan boyutu büyük bir ekleme metagenomic DNA kütüphanesini inşa etmek istiyorsanız, eşit veya 36 Kb aşması gerekir.

Bölüm II. Sezyum klorür degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak DNA saflaştırılması

Santrifüj hazırlanması: 1,5 - 2 saat
Santrifüj adım: 18 saat
Ethidium bromür (EtBr) Çıkarma ve santrifüj sonra DNA konsantre: 3 saat

Prosedür

Ayrıntılı bilgi için, Wright ve ark bakın. 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , DOI: 10.3791/1352

Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç

Toplam tutarı 2 orman toprağı organik g (Ç ufuk) ve mineral ufuklar (Ae, AB ve Bt ufuklar) (Uzun Vadeli Toprak Verimlilik (LTSP) Skulow göl, BC, Kanada konumda bulunan numune izole edilen genomik DNA M.Ö. Orman ve Range Bakanlığı tarafından yönetilen) 10 mg ile 180 mg arasında değişmektedir. - Izole edilmiş DNA ortalama büyüklüğü 40 ila 60 kb (Şekil 1) genellikle edildi. 260 nm/280 nm'de absorbans oranı 1,3-1,6 arasında ve genellikle toprak örneklerinde gözlenen hümik asit kirlenme gösterebilir 230 nm dalga boyunda bir tepe vardı. CSCL gradient santrifüj bu kirlenme önemli ölçüde azaltmış ve aynı zamanda 1.8 260/280 oranı arttı - 1.9 Şekil 2a ve 2b de gösterildiği gibi.

Şekil 1 CSCL Ultrasantrifügasyon önce çıkarılan genomik DNA PFGE resimler. lane1: 1 kb işaretleyici 100 ng, şerit 2: λHind III işaretleyici 100 ng, şerit 3: λHind III işaretleyici 250 ng, şerit 4: λHind III işaretleyici 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb işaretleyici 100 ng, şerit 6 ve 7: genomik mineral toprak ufuk Ae, şerit 8 ve 9 izole edilen DNA: LTSP yerinde Skulow göl, M.Ö. bulunan mineral toprak ufuk AB'dan genomik DNA izole

Genomik DNA Şekil 2 Chromograms önce spektrofotometre tarafından tespit edilen (A) ve (B) sonra CSCL Ultrasantrifügasyon. Genomik DNA kalitesinde düzelme gösterir CSCL Ultrasantrifügasyon sonra 230 nm dalga boyunda absorbans değeri azalma unutmayın. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.