Biology

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/159

Jocelyn LeBlanc¹, Teresa Venezia Bowman¹, Leonard Zon¹

¹Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Abstract

조혈 줄기 세포 (HSC)는 유기체의 생활 전반에 걸쳐 모든 차별화된 혈액 lineages을 유지 pluripotent 세포의 드문 인구입니다. HSC의 기능 정의는 reconstitute 조사받는 장기의 모든 혈액 lineages을 수있는 능력을 가진 세포 이식입니다. 이 지정은 포유류의 시스템에 있게한 작품의 수십에 의해 설립되었습니다. 조혈 세포 이식 (HCT)와 마우스의 반대로 유전자 조작을 사용하여, HSC 생물학의 기본 규제 요소가 발표되기 시작하지만, 여전히 대부분 아래 - 탐험입니다. 최근 zebrafish는 척추 조혈을 연구하는 강력한 유전자 모델로 떠오르고있다. zebrafish에서 HCT를 구축하는 것은 과학자들이 HSC 규정을 기본 메커니즘 소설을 나타내기 위해 zebrafish에서 사용할 수있는 대규모 유전 및 화학 검사 방법을 이용하실 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish에서 HCT를 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 절개 및 준비 zebrafish 전체 신장 골수의 조혈 zebrafish에있는 성인의 사이트 및 intracardiac 주사를 통해 조사받는 물고기의 순환에이 기증자 세포의 도입을 보여줍니다. 또한, 우리는 그들의 장기 건강을 높이기 위해 'ICU'에 물고기의 사후 이식 치료를 설명합니다. 물고기의 일반적인, 젠틀 케어 년 동안 전, 후 이식은 장기 평가 (<3 월) engraftment을 위해 필수적이며, 하나 이상 개월 다음과 같은 절차를 살아남을 것입니다 물고기의 수를 늘리는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 설정하는 데 사용 실험 데이터가 다른 곳으로 게시됩니다. 이 프로토콜의 설립 대규모 zebrafish의 유전 및 이식 생물학의 합병에 대한 수 있습니다.

Protocol

조사

이식하기 전에 25Gy 이일에 비추다의 WT 물고기

키드니 해부

tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / 생선 물 리터) (기증자 생선 당 500,000 세포의 평균)의 형광 기증자의 적절한 숫자를 희생
0.9X PBS + 5% FCS에 + 1퍼센트 펜 strep ( "PBS +") 튜브로 신장 분리
18 1 / 2 G의 바늘로 10ml의 주사기와 다음, 1ml pipet와 휴식
원뿔 50mL로 전송하고 PBS로 채워 +
@ 1500rpm 8min를 스핀 다운
40micron 필터를 통해 대량 및 필터에 resuspend 펠렛을 따르다
@ 1500rpm 8min를 스핀 다운
1ml PBS에 resuspend, 쏟다 +, eppendorf 튜브로 전송
카운트하려면 다음 단계를 따르십시오 10ul 세포 솔 + 90ul trypan 파랑 (지금은 10X 희석됩니다)
10ul 세포 솔 + 90ul PBS + (지금은 희석 수 있습니다 10X)
hemacytometer의 양쪽에 10ul 솔을 모두 추가 5 분 서 보자
사망 비율이 큰 박스 (5x5), 계정에 세포를 카운트 큰 경우
셀 / ML = (세포 개수) (10 ⁴⁾ (X10 dil. 계수)

예 - hemacytometer의 계산 60 세포는 세포 6,000,000 총입니다
샘플 @ 1500rpm을 스핀 8min
세포의 적절한 농도를 얻을 resuspend 펠렛의에 볼륨을 계산
3ul되고 WKM 및 2ul되고 주변 혈액 - 주사 5ul 총 볼륨
예 - 6000000 세포 전체를

받는 사람 당 200,000 개 셀을 이식하려는

20 수신자를

66,667 세포 / UL (200,000 개 셀 / 3ul)를 원하는

90ul에 resuspend 펠릿 (6,000,000 세포 / 세포 66667 / UL)

오직 그 60ul에 대한 필요 (20recip X 3ul)

주변 혈액 추출

캐리어 혈액 (기증자 당 2,000,000 세포의 평균)에 대한 tricaine (~ 100ml 4mg/ml Tricaine / 생선 물 리터)에 WT 물고기의 적절한 숫자를 희생
항응고제 : 1mL PBS에 희석 1ul (3unit/ul) +
헤파린과 외투 pipet 팁, pipet 팁과 아가미를 통해 찔러은 PBS에 혈액을 추가 +
1.5mL에 resuspend 1500rpm 5 분을 스핀
1mL에 resuspend 1500rpm 5 분을 스핀
40micron 필터를 통해 필터
위와 같이 세포 카운트
셀 / ML = (세포 개수) (10 ⁴⁾ (X10 dil. 계수)
죽음에 대한 계정
위와 같이 resuspension 볼륨을 계산

주사