הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

Summary

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב מאוחר

Abstract

המורפוגנזה של

Protocol

1. טרי להכין 2ml של פתרון מקבע המכיל Glutaraldehyde 12.5% ​​במאגר Cacodylate 50mm (pH7.4) בתוך צנצנת זכוכית 20 מ"ל הנצנץ. הוסף 8ml של n-heptane ומנערים במרץ. אפשר להפריד בין שני שלבים. הסר השלב העליון המכיל n-heptane רווי glutaraldehyde, מקום לתוך בקבוקון scintillation נקי ומניחים בצד. זה יהיה הפתרון מקבע.
2. איסוף עוברים שעה 0-20 באמצעות אוסף העובר קאמרית, שהוא סל קטן עם להוסיף רשת נשלפים. הסר את הקרום החיצוני סיסית על ידי השריית עוברים בפתרון אקונומיקה 50% במשך 2-3 דקות, או עד עוברי לצוף אל פני השטח של אקונומיקה. לשטוף ביסודיות עם עוברי ddH20 ואת כתם על מגבת נייר.
3. בעזרת מלקחיים, להרים להכניס רשת אשר מכוסה עוברים dechorionated ומקום לתוך הפתרון מקבע, המאפשר עוברים ליפול מן הרשת. אפשר לתקן את עוברי עבור 1.5 שעות ב 4 ° C תוך כדי ערבוב על Nutator.
4. הכינו צלחת פטרי מצופה קלטת דו צדדית. הסר עוברים מן מקבע באמצעות pipet פסטר ומניחים אותם על גבי משטח מודבק של פטרי dish.Transfer העוברים בסכום מינימלי של פתרון מקבע למנוע heptane ב מקבע מ המסת הדבק של הקלטת. נער את צלחת פטרי כדי ליצור שכבה יחידה של העוברים. מניחים צלחת פטרי במנדף עד מתאדה heptane. הוסף מספיק Tween20 PBS + 0.1% כדי לכסות את העוברים. יד devitellinize בסוף שלב 16 עוברים תחת מיקרוסקופ לנתח עם מחט טונגסטן בוטה. שחזור עוברים עם pipet פסטר לתוך צינור מ"ל 1.5 microfuge. צעדים 5-7 מתבצעים בתוך צינור זה microfuge.
5. לשטוף עוברים 0.1M Cacodylate חיץ, pH 7.4 ואז שלאחר לתקן בתמיסה המכילה tetroxide אוסמיום 1% ב 0.1M Cacodylate חוצץ, pH 7.4 שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו עוברי עם 0.1M Cacodylate חיץ, pH 7.4.
6. מייבשים עוברים בסדרה מדורגת של אתנול, אצטון. מייבשים עוברים עם אתנול 50% למשך 10 דקות, ואחריו אתנול 70% למשך 10 דקות. ואז מייבשים אצטון ב 90% במשך 10 דקות, ושני אצטון 100% מדרגות 10 דקות כל אחד.
7. הסר אצטון ואז להתחיל את תהליך חדירת ידי הוספת שרף-EPON Spurr 01:01: תערובת אצטון על עוברים. מיקרוגל במשך שלוש דקות באמצעות מיקרוגל Biowave Pelco Pro תוך שמירה על מדגם בלחץ ואקום. החל הלחץ ואקום המדגם עבור חמש דקות נוספות לאחר מיקרוגל הסתיים. הבורסה שרף 01:01, תערובת אצטון עם שרף-EPON Spurr 100% מיקרוגל שוב תחת לחץ ואקום. 100% Exchange-EPON Spurr שרף בפעם האחרונה, ו מיקרוגל בלחץ ואקום.
8. שימוש pipet פסטר, העוברים מועברים מהצינור microfuge לעצב הטבעה סיליקון. יישר עוברים בשורה כזאת, כי בסופו האחורי של העובר מתיישר עם הקצה החד של עובש. אופים בתנור 70 ° C במשך הלילה.
9. הסר מדגם ולהתכונן חתך.
10. בגין קיצוץ בסעיפים 1μm באמצעות סכין יהלום histo ריקרט Ultracut E Microtome. שימו לב, כאשר סעיף העובר הראשון הוא הגיע. מנקודה זו, לחתוך 100μm לתוך המדגם. הסר קטע באמצעות לולאה, ואת המקום לשקופית זכוכית. בקצרה החום סעיף על פלטה חשמלית. הכתם בסעיף באמצעות ירידה של מתילן בלו. תחת מיקרוסקופ אור לזהות את לומן לב.
11. חותכים סעיפים 90 ננומטר באמצעות Ultra יהלום 45 ° סכין ריקרט Ultracut E Microtome. תרימי מספר מקטעים על רשת הנחושת.
12. רשתות מגואלות אצטט uranyl 3% רווי באתנול 50% למשך עשר דקות ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים כפול. ואז, רשתות הם מוכתמים להוביל ציטרט (0.04gms מומס במים מזוקקים 10 מ"ל כפול NaOH 10M 100 מ"ל) עבור 2.5 דקות בתא המכיל כדורי NaOH ליצור CO ₂ ללא הסביבה. רשתות הן שטפה שלוש פעמים במים מזוקקים כפול.
13. מדורים נבחנים עם מיקרוסקופ אלקטרונים JEOL 1200EX ב 80Kv, וצילם עם מצלמה דיגיטלית AMT.

Discussion

המורפוגנזה של הצינור לב תסיסנית עובריים התפתחה כמערכת מודל חשוב ללימוד הידבקות התא שינויים בצורת התא במהלך ההתפתחות העוברית. אחד האתגרים העומדים בפני בלימוד מבנה זה הוא כי לומן של הצינור לב קשה לחזות בעוברים הר שלם. הטכניקה הפגינו וידאו זה, אשר הותאמה מהנהלים שתואר לעיל ^1-2, הוכיח להצליח יעיל ומהימן ניתוח מספר לא מבוטל של גנוטיפים עבור צינור לב היווצרות לומן ^3.