إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

Summary

نحن تصف عملية لترسيخ وتثبيت ، sectioning ، والتصوير من مرحلة متأخرة

Abstract

في التشكل من

Protocol

1. تعد طازجة 2ml حل تثبيتي غلوتارالدهيد تحتوي على 12.5 ٪ في المخزن كاكوديلات 50mM (pH7.4) في قارورة زجاجية 20 مل التلألؤ. إضافة 8ml من N - هيبتان ويهز بقوة. السماح للمرحلتين منفصلتين. إزالة المرحلة العليا التي تحتوي على N - هيبتان مشبعة غلوتارالدهيد ، مكان إلى قارورة التلألؤ نظيفة وتوضع جانبا. وسوف يكون هذا هو الحل مثبت.
2. جمع الأجنة 00-20 ساعة باستخدام غرفة جمع الأجنة ، وهي سلة صغيرة مع ادخال شبكة القابلة للإزالة. إزالة الغشاء الخارجي المشيماء الأجنة تمرغ في محلول التبييض 50 ٪ لمدة 2-3 دقائق أو حتى الأجنة تطفو الى السطح من التبييض. شطف جيدا مع أجنة ddH20 وصمة عار على منشفة ورقية.
3. باستخدام الملقط ، التقط ادخال شبكة وهو مغطى الأجنة dechorionated ومكان في حل تثبيتي ، والسماح لأجنة تسقط من عيون. السماح للأجنة لإصلاح 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية في حين خلط على Nutator.
4. إعداد طبق بتري واصطف مع وجهين الشريط. إزالة أجنة من تثبيتي باستخدام الماصة باستور ووضعها على سطح مسجلة من dish.Transfer بيتري الأجنة في الحد الأدنى من حل تثبيتي لمنع هيبتان تثبيتي في حل من الغراء الشريط. يهز طبق بيتري لجعل طبقة واحدة من الأجنة. طبق بتري في مكان غطاء حتى يتبخر هيبتان. إضافة يكفي PBS Tween20 + 0.1 ٪ لتغطية الأجنة. اليد devitellinize أواخر المرحلة 16 الأجنة تحت المجهر تشريح بإبرة حادة التنغستن. استعادة أجنة مع الماصة باستور في أنبوب 1.5 مل microfuge. وتنفذ الخطوات 5-7 في microfuge هذا الأنبوب.
5. شطف الأجنة في 0.1M كاكوديلات العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4 ثم في محلول يحتوي على 1 ٪ في رباعي أكسيد الأوزميوم 0.1M كاكوديلات العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة إصلاح آخر. شطف الأجنة مع 0.1M كاكوديلات العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4.
6. يذوى الأجنة في سلسلة متدرجة من الايثانول والأسيتون. يذوى الأجنة الايثانول مع 50 ٪ لمدة 10 دقيقة ، تليها الإيثانول 70 ٪ لمدة 10 دقيقة. يذوى ثم في الأسيتون 90 ٪ لمدة 10 دقيقة ، واثنين من الاسيتون 100 ٪ الخطوات من 10 دقيقة لكل منهما.
7. الأسيتون إزالة ومن ثم تبدأ عملية تسلل بإضافة EPON - Spurr 01:01 الراتنج : مزيج الأسيتون إلى الأجنة. الميكروويف لمدة ثلاث دقائق باستخدام الميكروويف بيلكو برو Biowave مع الحفاظ على عينة تحت ضغط الفراغ. الضغط على فراغ العينة لخمس دقائق إضافية بعد الميكروويف قد انتهت. تبادل الراتنج 1:1 ، مزيج الأسيتون مع الراتنج EPON Spurr - 100 ٪ والميكروويف مرة أخرى تحت ضغط الفراغ. صرف 100 ٪ EPON - Spurr راتنج مرة أخيرة ، والموجات الدقيقة تحت ضغط الفراغ.
8. باستخدام الماصة باستور ، يتم نقل الأجنة من أنبوب microfuge إلى سيليكون العفن التضمين. محاذاة الأجنة في صف واحد مثل هذا الامر في نهاية الخلفي للجنين بمحاذاة الحافة مع مدبب من العفن. يخبز في فرن 70 درجة مئوية خلال الليل.
9. إزالة العينة والتحضير لsectioning.
10. تبدأ خفض 1μm المقاطع باستخدام سكين Histo الماس وريشير Ultracut مشراح E. يحيط علما عندما يتم التوصل إلى قسم أول جنين. من هذه النقطة ، وقطع 100μm في العينة. إزالة المقطع باستخدام حلقة ، ومكان على شريحة زجاجية. الحرارة لفترة وجيزة المقطع على طبق ساخن. وصمة عار المقطع باستخدام قطرة الميثيلين الأزرق. تحت المجهر ضوء تحديد تجويف القلب.
11. قطع المقاطع 90nm باستخدام الترا الماس 45 درجة سكين وريشير Ultracut مشراح E. التقاط مقاطع متعددة على الشبكة النحاسية.
12. هي ملطخة الشبكات مع خلات اليورانيل 3 ٪ المشبعة في الإيثانول 50 ٪ لمدة عشر دقائق ثم تشطف ثلاث مرات في الماء المقطر مزدوجة. ثم ، وأساء إلى شبكات مع سترات الرصاص (0.04gms المذاب في الماء المقطر 10ML المزدوجة وهيدروكسيد الصوديوم 100ML 10M) لمدة 2.5 دقيقة في غرفة تحتوي على كريات هيدروكسيد الصوديوم لخلق CO ₂ بيئة خالية. وتشطف ثلاث مرات في شبكات الماء المقطر مزدوجة.
13. يتم فحص الأجزاء مع المجهر الإلكتروني JEOL 1200EX في 80Kv ، وتصويرها بكاميرا رقمية AMT.

Discussion

برزت التشكل من القلب الجنينية ذبابة الفاكهة أنبوب كنظام نموذجا قيما لدراسة التصاق الخلايا ويتغير شكل الخلية أثناء التطور الجنيني. واحدة من التحديات التي تواجهها في دراسة هذا الهيكل هو أن تجويف أنبوب القلب من الصعب تصور الأجنة في جبل بأكمله. وقد أثبتت هذه التقنية تظاهروا في هذا الفيديو ، الذي تم تكييفه من الإجراءات المذكورة سابقا ^1-2 ، لتكون ناجحة في كفاءة وموثوق بها وتحليل عدد كبير من المورثات لأنبوب تجويف القلب وتشكيل ^3.