Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Fixierung, Einbettung, Schneiden und Bildgebung von spät
Abstract
Die Morphogenese der
Protocol
- Frisch vorzubereiten 2ml einer Fixierlösung mit 12,5% Glutaraldehyd in 50 mM Cacodylatpuffer (pH 7,4) in einem 20 ml Glasszintillationsröhrchen. Add 8ml von n-Heptan und kräftig schütteln. Lassen Sie die zwei Phasen zu trennen. Entfernen Sie den oberen Phase mit n-Heptan mit Glutaraldehyd gesättigt, statt in ein sauberes Scintillationsfläschchen und beiseite stellen. Dies wird die Fixierlösung werden.
- Sammeln 0-20 Stunden Embryonen mit einer Embryo-Entnahme-Kammer, die einen kleinen Korb mit einem herausnehmbaren Siebeinsatz ist. Entfernen Sie die äußere Membran Chorion durch Einweichen Embryonen in eine 50% ige Chlorbleichlauge für 2-3 Minuten, oder bis Embryonen schwimmen an der Oberfläche der Bleiche. Gründlich mit ddH20 und blot Embryonen auf einem Papiertuch.
- Mit einer Pinzette, abholen Netzeinsatz mit dechorionated Embryonen und Stelle in die Fixierlösung bedeckt ist, so dass Embryonen aus dem Netz fallen. Lassen Embryonen für 1,5 Stunden bei 4 ° C fix beim Mischen auf einem Kolbenpendel.
- Bereiten Sie eine Petrischale mit doppelseitigem Klebeband ausgekleidet. Entfernen Embryonen aus der Fixierlösung mit einer Pasteur-Pipette und legen Sie sie auf verschweißte Oberfläche Petri dish.Transfer die Embryonen in einer minimalen Menge Fixativ Lösung für das Heptan in das Fixiermittel aus Auflösung der Kleber des Bandes zu verhindern. Schütteln Sie die Petrischale zu einer einzigen Schicht von Embryonen zu machen. Legen Sie Petrischale in der Kapuze bis Heptan verdunstet. Fügen Sie genug PBS + 0,1% Tween20, die Embryonen zu decken. Hand-devitellinize späten Stufe 16 Embryonen unter einem Binokular mit einem stumpfen Wolframnadel. Recover Embryonen mit einer Pasteur-Pipette in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Schritte 5-7 sind in diesem Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt.
- Spülen Embryonen in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4 und dann in einer Lösung mit 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4 für 1 Stunde bei Raumtemperatur post-fix. Spülen Embryonen mit 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,4.
- Entwässern Embryonen in einer abgestuften Reihe von Ethanol und Aceton. Entwässern Embryonen mit 50% Ethanol für 10 Minuten, gefolgt von 70% Ethanol für 10 Minuten. Dann in 90% Aceton entwässern für 10 Minuten und zwei 100% Aceton Schritten von jeweils 10 Minuten.
- Entfernen Aceton und dann beginnen die Infiltration durch Zugabe einer 1:1-Epon-Harz Spurr: Aceton-Gemisch, um die Embryonen. Mikrowelle für 3 Minuten mit einem Pelco Biowave Pro Mikrowelle, während die Probe unter Vakuum. Bewerben Unterdruck, um die Probe für weitere fünf Minuten nach der Mikrowelle ist beendet. Austausch der 1:1-Harz, Aceton-Gemisch mit 100% Epon-Spurr Harz und Mikrowelle wieder unter Vakuum. Tauschen Sie die 100% Epon-Spurr Harz ein letztes Mal, und Mikrowelle unter Vakuum.
- Mit einer Pasteur-Pipette, sind Embryonen, die von der Mikrozentrifugenröhrchen ein Silikon Einbettform übertragen. Richten Embryonen in eine Reihe, so dass das hintere Ende des Embryos mit dem sich verjüngenden Rand der Form ausgerichtet ist. Backen Sie in einem 70 ° C im Ofen über Nacht.
- Entfernen Probe und Vorbereitung für das Schneiden.
- Begin Schneiden 1 &mgr; Abschnitte mit einer Diamant-Histo Messer und Richert Ultracut E Mikrotom. Beachten Sie, wenn der erste Embryo Abschnitt erreicht ist. Von diesem Punkt schnitt 100 um in die Probe. Nehmen Sie einen Abschnitt mit einer Schleife, und platzieren Sie auf einen Objektträger. Kurz erhitzen Abschnitt auf einer heißen Platte. Stain Abschnitt mit einem Tropfen Methylenblau. Unter dem Lichtmikroskop zu identifizieren Herzen Lumen.
- Cut 90nm Abschnitte mit einer Diamant-ultra 45 ° Messer und Richert Ultracut E Mikrotom. Pick up mehrere Abschnitte auf einer Kupfer-Netz.
- Grids werden mit 3% Uranylacetat in 50% Ethanol für 10 Minuten gesättigt gefärbt und dann gespült dreimal in doppelt destilliertem Wasser. Dann werden die Gitter mit Bleicitrat (0.04gms in 10ml doppelt destilliertem Wasser und 100 ml 10 M NaOH gelöst) für 2,5 Minuten in eine Kammer mit NaOH-Pellets zu einer CO 2-freie Umgebung zu schaffen gefärbt. Die Gitter sind dreimal in doppelt destilliertem Wasser gespült.
- Die Schnitte werden mit einem JEOL 1200EX Elektronenmikroskop bei 80 kV untersucht und fotografiert mit einer AMT Digitalkamera.
Discussion
Die Morphogenese der Drosophila embryonale Herz Rohr hat als wertvolles Modellsystem für die Untersuchung von Zell-Adhäsions-und Zell Formveränderungen während der embryonalen Entwicklung entstanden. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung dieser Struktur konfrontiert ist, dass das Lumen des Herzens Rohr nur schwer in whole mount Embryonen sichtbar ist. Die Technik in diesem Video gezeigt, die aus zuvor beschriebenen Verfahren 2.1 angepasst wurde, hat sich als effizient und zuverlässig in der Analyse eine erhebliche Anzahl von Genotypen für Herz-Rohr und Lumenbildung 3 erfolgreiche.
Acknowledgments
Unsere Arbeit auf Herz tube formation wurde von der National Science Foundation Grant (Auszeichnung ID 0744165) auf SGK unterstützt
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
